抗胞外基质蛋白的RGD氨基酸序列的抗体及其制法与用途制造技术

本发明专利技术提供特异性识别人及小鼠的胞外基质蛋白的ＲＧＤ氨基酸序列的单克隆抗体。通过特异性抑制ＲＧＤ序列介导的黏附，可期待对炎症、癌、传染病、自身免疫、骨质疏松症等疾病有显著效果，同时可期待减轻副作用，对于这些疾病可提供更好的治疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗胞外基质蛋白的RGD氨基酸序列的抗体及 采用该抗体的癌、炎症性疾病、自身免疫疾病、传染病、骨疾 病的预防、治疗方法及i貪断方法。
技术介绍
细胞翁附在多细胞生物的生命维持中发挥着重要的作用。 多细胞生物的细胞黏附可分为细胞-胞外基质间黏附与细胞-细 胞间翁附，已知细胞-胞外基质间黏附中，整联蛋白参与细胞黏 附；细胞-细胞间黏附中，钙黏着蛋白、密蛋白(claudin)、柄 蛋白等参与细胞縣附。此外，这些黏附分子不仅有细胞黏附的功能，还逐渐发现其与信号向细胞内的传导直接相关。连结细胞与胞外基质的黏附由以整联蛋白为代表的跨膜细 胞黏附蛋白构成。整联蛋白由a链与(3链的异二聚体构成，通过 不同的a链与卩链的组合，至少存在24种整联蛋白分子，分别与 特异的胞外基质分子结合。由此，包括整联蛋白在内的跨膜细 胞黏附蛋白不仅参与细胞与胞外基质的黏附，还以信号的方式 向细胞内传导胞外基质来源的信息，调节细胞的增殖、运动、 细月包死亡、分4匕等(F. G. Giancotti, et al., Science, 285, 1028-1032, 1999 )。已知胞外基质分子的种类可分为胶原类(1 XIX型等)、 非胶原糖蛋白类(骨桥蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血 友病(von Willebrand )因子、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋 白原、血小板反应蛋白等)，弹性蛋白类及蛋白聚糖类(硫酸乙 酰肝素聚糖等)，有多种蛋白质；这些胞外基质分子(配体)与对应的整联蛋白结合，活化细胞内的信号传导通路，进而调节 细胞骨架形成、移动、增殖、分化等。即，与配体结合的整联 蛋白与细胞表面的受体型酪氨酸激酶协同调控这些信号活性通 路，依据配体种类的不同，其对应的整联蛋白传导各种不同的信号。多种胞外基质蛋白共同存在的细胞黏附区域有RGD (精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列。从而，胞外基质蛋白的RGD序 列通过与整联蛋白勒附而发挥多种功能，其作为药物靶标受到 关注，被制成多种低分子化合物及合成肽。与RGD序列结合的整联蛋白中，存在a3(31、 a5pi、 a8pl、 av卩l、 av卩3、 av卩5、 av卩6、 av卩8。至今为止，整联蛋白介导的 信号传导机制的研究以阐明a5(31与作为其特异性配体的纤连 蛋白的相互作用为中心而进行。其结果发现a5pi不仅调控细胞 黏附与细胞移动，也调控细胞的分化及细胞死亡(S.M. Frisch et al. : Curr. Opin. Cell Biol., 9， 701-706, 1997 )。然而，整 联蛋白介导的信号因配体而不同，纤连蛋白所黏附的内皮细 胞受增殖因子的刺激而显示出增殖活性，-f旦同样的细胞与层 粘连蛋白-l黏附后，增殖活性丧失，反而表现为增殖抑制。 此外，与来自纤连蛋白的由a5pi介导的信号不同，来自层粘连 蛋白-10/11的由a3pi介导的信号强烈促进癌细胞的运动(J. Gu et al., J . Biol. Chem.， 276, 27090-27097, 2001 )，强烈回避由 血液饥-賊而导致的细月包凋亡(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 277， 19922-19928， 2002 )。与I(GD序歹ll结A的整耳关*白中，av整耳关 蛋白在破骨细胞及新生血管中高表达，av整联蛋白成为骨质疏 松症及癌治疗药的靶标分子。此外，a5pl整if关蛋白在肺瘤细胞 中高表达，显示出与癌的恶性化相关。据此，开发出作为抑制 胞外基质蛋白与整联蛋白结合的拮抗物，即作为抗整联蛋白抗 体的药品的抗a5(31整联蛋白抗体(Volocimab)、抗a4整耳关蛋白抗体(Natalizumab )、抗avp3整联蛋白抗体(Vitaxin )。另一方面，含有RGD序列的胞外基质蛋白已知有胶原、骨 桥蛋白(OPN )、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病(von Willebrand)因子、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原、血 小板反应蛋白等。此外，病毒及细菌也有RGD序列，和其与细 胞的教附有关。含有RGD序列的OPN为骨中大量含有的钙结合 性的酸性糖蛋白，担负着细胞黏附、细胞迁移、肺瘤形成、免 疫应答以及补体介导的细胞溶解等多种重要功能。此外，采用 OPN的缺陷小鼠及使用中和抗体的分析中显示，其与肝炎、风 湿性关节炎等自身免疫性疾病及癌转移相关。从而，通过抑制 RGD介导的细胞与胞外基质蛋白的黏附，可期待骨质疏松症及 癌的治疗，因此与整联蛋白相反，也可从胞外基质蛋白的角度 开发拮抗物药 品O
技术实现思路
至今为止，虽制作有抑制RGD序列介导的与整联蛋白的相 互作用的低分子化合物及合成肽、抗OPN及整联蛋白的抗体， 但不存在抗RGD序列的特异性抗体。此外，抗OPN及整联蛋白 的抗体由于抑制RGD序列之外的胞外基质蛋白与整联蛋白的 结合，会在生物体内产生非目的的作用，有发生副作用的可能。因此，期待通过特异性抑制RGD序列介导的黏附，从而对 炎症、癌、传染病、自身免疫、骨质疏松症等疾病有显著效果， 同时减轻副作用，迫切希望提供这些疾病的更好的治疗法。此 外，用病理模型动物评价抗人OPN抗体及抗人整联蛋白抗体的 效果时，因该抗体与该动物的靶标蛋白或肽不发生交叉反应， 通常采用抗该动物的靶标蛋白或肽的异种动物的抗体来进行药 效评价，给予人的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体与采用病理模型动物评价的抗体完全不同。这在药品的开发上是重大的问 题点，因此期望可采用治疗人时使用的抗体通过病理模型动物 来评价其治疗效果。本专利技术人等以抑制RGD序列介导的胞外基质蛋白与整联 蛋白的结合为目的，就抗RGD序列的抗体的制作进行了各种研 究，结果发现用含有RGD序列的小鼠OPN的部分肽能制作小鼠 的单克隆抗体，该抗RGD序列的抗体与人胞外基质蛋白的RGD 序列也发生交叉反应，具有抗炎症效果、抗癌效果等，从而完 成了本专利技术。即，具体来"i兌，本专利技术提供以下所述的抗RGD抗体、该抗 RGD抗体的制造方法、含有该抗RGD抗体作为有效成分的癌、 炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病以及骨病的诊断剂及治 疗剂，以及该抗RGD抗体的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的制造方法等。(1 ) 一种抗RGD抗体，其含有序列号l 12中任意一种氨基酸序列。(2) —种抗RGD抗体，其含有序列号l、 3、 5、 7、 9或11 的氨基酸序列。(3) —种抗RGD抗体，其含有序列号l、 3、 5、 7、 9及11 的氨基酸序列。(4) 一种抗RGD抗体，其含有序列号2、 4、 6、 8、 10或 12的氨基酸序列。(5) —种抗RGD抗体，其含有序列号2、 4、 6、 8、 10及 12的氨基酸序列。(6 )根据上述(1 ) ~ ( 5 )中任意 一 项所述的抗RGD抗 体，其中，重链的互补性决定区域(CDRH)中的氨基酸序列 含有序列号l ~ 6中任意一种氨基酸序列，轻链的互补性决定区域(CDRL)中的氨基酸序列含有序列号7 12中任意一种氨基酸序列。(7 )根据上述(1 ) ~ ( 6 )中任意 一 项所述的抗RGD抗 体，其特异性识别人、小鼠、或这两者的胞外基质蛋白的RGD序列。(8) 根据上述(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＲＧＤ抗体，其含有序列号１～１２中任意一种氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：今重之，木村千惠美，上出利光，
申请(专利权)人：株式会社遗传科技，
类型：发明
国别省市：JP[日本]