癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障的药物传输系统技术方案

本发明专利技术的目的在于弄清脑转移中BBB的破坏机理，提供癌的脑转移的新型诊断/风险评估方法、以及治疗/预防方法。另外，本发明专利技术的目的在于提供新型的向脑输送药物的方法。进一步，本发明专利技术的目的在于提供在这些方法中使用的药物、组合物及试剂盒。因此，本发明专利技术涉及包括确定样本中的miR‑181c水平的脑转移的诊断或脑转移的发生风险的评价方法。另外，本发明专利技术涉及包括抑制癌患者的miR‑181c的表达或活性的治疗或预防脑转移的方法。进一步，本发明专利技术涉及利用了miR‑181c或PDPK1的使血脑屏障的透过性亢进的方法以及使期望的活性成分通过血脑屏障而到达脑内的方法。

Diagnosis, prevention and treatment of brain metastases from cancer, and drug delivery systems for use in blood-brain barrier

The aim of the present invention is to clarify the mechanism of BBB damage in brain metastases, provide a new diagnostic / risk assessment method for cancer brain metastases, and treat / prevent methods. In addition, the present invention aims to provide a new method of delivering drugs to the brain. Furthermore, the aim of the present invention is to provide drugs, compositions and kits used in these methods. Therefore, the present invention relates to diagnostic evaluation or brain metastasis risk method to determine samples of miR 181c level of brain metastasis. In addition, the invention relates to a method for the treatment or prevention of brain metastases include inhibition of cancer patients with miR 181c expression or activity. Further, the invention relates to the use of the blood brain barrier hyperpermeability method miR 181c or PDPK1 as well as the active ingredients and desired method of reaching the brain through the blood-brain barrier.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障的药物传输系统
本专利技术涉及血脑屏障的透过性控制，特别是使血脑屏障的透过性亢进(提高)的技术。进一步，本专利技术涉及癌的脑转移领域。更具体而言，本专利技术涉及脑转移的诊断或风险评估、以及脑转移的治疗或预防领域。
技术介绍
已知癌症患者的脑转移关系到预后不良。另外已知，在脑转移中，癌细胞通过血脑屏障(BBB)是重要事件；BBB的主要构成细胞是脑微血管内皮细胞(BMECs)；BMECs通过细胞间的紧密连接(tightjynctions)而相互结合，并由此而具有极具选择性的透过性。另外，作为构成紧密连接的蛋白质，已知有交联粘附分子(junctionaladhesionmolecules:JAM-1、JAM-2及JAM-3)、闭合蛋白(occludin)、密蛋白(claudins)及粘膜闭合蛋白(zonulaoccludinproteins:ZO-1及ZO-2)。进一步，作为参与癌细胞侵袭BBB的介质，已被确定的有：环氧化酶-2(COX-2)、表皮生长因子受体(EGFR)配体HB-EGF、及α2,6-唾液酸转移酶(ST6GALNAC5)。然而，有关癌细胞通过BBB的初期阶段的分子机理尚不明确(非专利文献1)。在使用了作为高转移性乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞的研究中，已有报道，在乳腺癌细胞中高度表达的血管内皮细胞生长因子(VEGF)会在提高内皮细胞的透过性的同时使癌细胞相对于内皮细胞的粘附增加，因此VEGF参与脑转移(非专利文献2)。然而，也有虽然VEGF的表达对于脑转移而言是必要的、但并不是仅基于该原因就会发生脑转移的报道，VEGF并不是能够充分说明脑转移中BBB的破坏的物质(非专利文献3)。另一方面，已进行了针对会感染中枢神经系统(CNS)的新型隐球菌如何通过BBB的研究，并有如下报道：通过隐球菌对人类BMECs的粘附，会发生丝切蛋白(cofilin)的去磷酸化，从而发生肌动蛋白的重组。在该报道中进一步显示，由隐球菌引起的丝切蛋白的去磷酸化在经过Rho激酶-LIM激酶-丝切蛋白通路后得到控制(非专利文献4)。已知包含外来体的细胞外囊泡(EVs)通过对包封的蛋白质、mRNA及微RNA(miRNA)进行运输而居间地实现细胞间信息传递(非专利文献5)。另外，由癌细胞释放的细胞外囊泡会抑制NK细胞的功能(非专利文献6)、提高骨髓祖细胞的MET癌蛋白的表达而导致其转化为促转移性(pro-metastatic)的性状(非专利文献7)等，从各种观点考虑，其均会关系到癌细胞的恶性程度(非专利文献8)。这样，尽管已有EVs与癌转移之间的关系的启示，但是关于EVs及其中包封的物质与BBB之间的关系，还完全是未知的。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Arshad、F.等、PathologResInt2011:920509(2010).非专利文献2：Lee、T.H.等、JBiolChem278:5277-5284(2003).非专利文献3：Yano、S.等、CancerRes60:4959-4967(2000).非专利文献4：Chen、H.M.Steven等、JournalofMedicalMicrobiology52:961-970(2003).非专利文献5：Valadi、H.等、NatCellBiol9:654-659(2007).非专利文献6：Liu、Cunren等、TheJournalofImmunology176:1375-1385(2006)非专利文献7：Peinado、H.等、NatMed18:883-891(2012).非专利文献8：Yang、C.等、ClinDevImmunol2011:842849(2011).
技术实现思路
本专利技术的目的在于弄清脑转移中BBB的破坏机理，提供癌的脑转移的新型诊断和/或风险评估方法、以及治疗和/或预防方法。另外，本专利技术的目的在于提供新型的利用了BBB破坏机理的向脑输送药物的方法。进一步，本专利技术的目的在于提供在这些方法中使用的药物、组合物及试剂盒等。本专利技术人等为了弄清脑转移的机理而将转移能力高的人类乳腺癌细胞系移植给小鼠，并针对由发生了脑转移的癌细胞得到的EVs进行了解析。结果发现：癌细胞来源的EVs会被导入脑微血管内皮细胞，以及，会因导入了癌细胞来源的EVs而导致血脑屏障(BBB)受到破坏。进而，本专利技术人等针对EVs所包含的物质中与血脑屏障的破坏有关的物质进行了研究，结果发现，作为脑转移癌细胞来源的EVs中特异性地包含的微RNA的miR-181c，具有破坏血脑屏障的作用。为此，本专利技术人等针对miR-181c在脑微血管内皮细胞内的作用进行了研究，结果发现，miR-181c会与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(以下称为“PDPK1”)的非翻译区结合而减少其表达。进一步，本专利技术人等对PDPK1的表达减少与血脑屏障(BBB)破坏之间的关系进行了研究，结果发现，通过抑制PDPK1的表达，会改变紧密连接蛋白的定位。由此，本专利技术人等发现，癌细胞来源的EVs通过在脑微血管内皮细胞内释放其所包封的miR-181c而抑制PDPK1的表达，并由此改变紧密连接蛋白的定位而破坏血脑屏障。就miR-181c而言，虽然已有报道显示其参与细胞的逐渐恶化，但迄今为止，其与血脑屏障的关系尚属未知。另外，已知PDPK1主要以蛋白激酶B(PKB/AKT1、PKB/AKT2、PKB/AKT3)、p70核糖体蛋白S6激酶(RPS6KB1)、p90核糖体蛋白S6激酶(RPS6KA1、RPS6KA及RPS6KA3)、环AMP依赖性蛋白激酶(PRKACA)、蛋白激酶C(PRKCD及PRKCZ)、血清及糖皮质激素诱导性激酶(SGK1、SGK2及SGK3)、p21活性化激酶-1(PAK1)、蛋白激酶PKN(PKN1及PKN2)为靶标而参与细胞增殖和存活的调节、葡萄糖及氨基酸的摄取和存储，但迄今为止尚无关于其与血脑屏障的关系的报道。因此，本专利技术是在弄清了脑转移癌细胞破坏血脑屏障的机理的基础上而完成的，具体涉及下述专利技术。(1)提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。(2)提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的方法，其包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的步骤，其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者具有脑转移的信息。(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，上述受试癌症患者是IV期癌症患者。(4)提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。(5)提供用于评估受试癌症患者发生脑转移的风险的信息的方法，其包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的步骤，其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者发生脑转移本文档来自技高网...

【技术保护点】
提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR‑181c水平进行测定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。2.提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的方法，其包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤，根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的步骤，其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者具有脑转移的信息。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，上述受试癌症患者是IV期癌症患者。4.提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。5.提供用于评估受试癌症患者发生脑转移的风险的信息的方法，其包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤；根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的步骤；其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者发生脑转移的风险高的信息。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，上述受试癌症患者是I～III期癌症患者。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，上述受试癌症患者是乳腺癌患者。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，上述阴性比较对象是没有发生脑转移的癌症患者或健康人。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，上述样本为血液。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，样本中的miR-181c是从样本中的EVs提取出的miR-181c。11.体外诊断用试剂或体外诊断用测定器，其用于在权利要求1～10中任一项所述的方法中使用，是通过测定miR181c而用于脑转移的诊断或风险评估的体外诊断用试剂或体外诊断用测定器。12.用于脑转移的诊断或风险评估的药物，其具备与miR-181c特异性结合的物质。13.根据权利要求12所述的药物，其中，上述与miR-181c特异性结合的物质是与miR-181c特异性结合的核酸。14.根据权利要求13所述的药物，其中，上述与miR-181c特异性结合的核酸是至少一部分具有人工设计的序列的核酸。15.根据权利要求12～14中任一项所述的药物，其中，与miR-181c特异性结合的物质经过了标记。16.用于抑制脑转移的药物组合物，其含有选自miR-181c的表达抑制剂、miR-181c的活性抑制剂、及外来体分泌抑制剂中的1种以上药物作为有效成分。17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，选自miR-181c的表达抑制剂、miR-181c的活性抑制剂及外来体分泌抑制剂中的药物是选自下组中的药物：(i)针对pri-miR-181c或pre-miR-181c的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；(ii)miR-181c的反义寡核苷酸、与miR-181c特异性结合的适配子、针对miR-181c的siRNA、或miR-181c的miRNA模拟物；(iii)针对nSMase2基因和/或RAB27B基因的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；或者，(iv)针对nSMase2和/或RAB27B的抗体或其免疫反应性片段；与nSMase2和/或RAB27B特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者，nSMase2和/或RAB27B的拮抗剂。18.用于使血脑屏障的透过性亢进的药物组合物，其含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分。19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中，上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂是针对PDPK1基因的反义寡核苷酸、与PDPK1基因特异性结合的适配子、针对PDPK1基因的siRNA、或能够抑制PDPK1基因的表达的miRNA；或者是针对PDPK1的抗体或其免疫反应性片段；与PDPK1特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者是PDPK1的拮抗剂。20.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：落谷孝广，富永直臣，
申请(专利权)人：株式会社遗传科技，独立行政法人国立癌症研究中心，特里奥科技株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP