天然形式人自分泌运动因子特异的抗体、其筛选方法、以及通过测定自分泌运动因子而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂技术

本发明专利技术提供了特异性识别未受到变性的、在生物体内的存在状态中的天然形式人自分泌运动因子的抗体的筛选方法，该方法包括以下步骤：将能够捕获该抗体的候选抗体的结合因子结合在固相上；将该抗体的候选抗体与所述结合因子结合；使天然形式人自分泌运动因子在已经使所述候选抗体作用的体系中作用；和以天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力作为指标，选择特异性识别该天然形式人自分泌运动因子的抗体。本发明专利技术还提供了恶性淋巴瘤的检测方法，其包括：测定人样品中自分泌运动因子的浓度并且在所述测定值显示比由源自正常健康受试者的测定值组成的正常值显著更高值的情况下判定是恶性淋巴瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】天然形式人自分泌运动因子特异的抗体、其筛选方法、以及通过测定自分泌运动因子而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂
本专利技术涉及特异性识别并结合天然形式人自分泌运动因子(autotaxin)的抗体、其筛选方法、以及通过测定人样品中的自分泌运动因子浓度而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂。
技术介绍
人自分泌运动因子是具有约125kDa分子量的糖蛋白，该蛋白质在1992年首次由M.L.Stracke等从A2058人黑素瘤细胞的培养基中作为诱导细胞运动性的物质分离(J.Biol.Chem.，256，2524，1992)。随后，1994年J.Murata等使用cDNA克隆分析其结构，明确了该蛋白质在氨基末端侧具有单一跨膜部分，在胞外结构域中包含2个生长调节素B区、I型磷酸二酯酶活性区、和EF手型的环区，具有磷酸二酯酶活性(J.Biol.Chem.，269，30479，1994)。然而，仍没有获得任何明确的涉及自分泌运动因子诱导细胞运动性的功能的证据。2002年，在人(A.Tokumura等，J.Biol.Chem.，277，39436，2002)和牛血清(M.Umezu-Goto等，J.CellBiol.，158，227，2002)中鉴定到新的溶血磷脂酶D，从而首次证实由这种酶活性所产生的溶血磷脂酸诱导细胞运动性。基于自分泌运动因子运动性诱导功能的推断，Stracke等在美国专利号5,499,753(1995)中描述使用自分泌运动因子作为人癌侵润能力的标志物。此外，Stracke等也在美国专利号5,731,167(1998)中提出通过施用与毒素结合的抗自分泌运动因子抗体的癌症疗法。这样就需要特异性识别人自分泌运动因子的抗体，但由于自分泌运动因子相对大量地以多种形式含于动物血清中，故认为极难获得针对通常存在于血清中的没有经历突变的自分泌运动因子(天然形式的自分泌运动因子)具有特异性和强大结合力的抗体。实际上，没有用于定量自分泌运动因子本身的方法，并且目前通过评价其具有的溶血磷脂酶D活性间接地定量自分泌运动因子。用于测定这种酶的活性的方法是复杂的并且通常需要几个小时与底物的孵育时间以使此酶发挥酶活性。此外，还存在干扰性因素，如可能在人样品中存在与自分泌运动因子不同的具有溶血磷脂酶D活性的其它酶、在人样品中存在因酶活性测定期间溶血磷脂酰胆碱底物分解而产生的溶血磷脂酸和胆碱。这些内在因素至少对酶活性测定中人自分泌运动因子的特异性定量产生一些影响，不是用于定量人自分泌运动因子的高精度方法。实际上，胆碱以约数十mM的浓度含于人精浆中，并且若没有进行胆碱去除的预处理，则难以基于使用溶血磷脂酰胆碱作为底物所生成的胆碱量而测定精浆中的活性。为数众多的单克隆抗体已经由几个研究组(包括我们的研究组)通过用大肠杆菌(Escherichiacoli)表达人自分泌运动因子的合成的部分肽或部分序列、免疫可溶性人自分泌运动因子而建立(JournalofBiologicalChemistry，269，30479-30484，1994，FEBSLetters，571，197-204，2004)。然而，尽管人自分泌运动因子可以通过使用这些抗体的蛋白质印迹法检测，然而这些抗体对人样品中存在的天然形式人自分泌运动因子不表现任何反应性或仅表现极低水平的反应性。因此，极难将这些抗体应用于以人样品为对象的ELISA测定法等免疫学测定法中，并且它们仍没有实际使用。根据本专利技术，可以极高效地建立与人样品中天然形式的人自分泌运动因子特异性反应的单克隆抗体。也就是说，在通过抗原免疫、细胞融合而制备单克隆抗体时的筛选方法中，通过选择以与溶液中存在的天然形式抗原的反应性作为指标的抗体，可以建立基于通用方法如ELISA的人自分泌运动因子定量测定体系。此外，由所述方法获得的抗体是高性能抗体，其通过能够高效结合并捕获含于血液等中的人自分泌运动因子，不仅能够自样品除去抗原，还能够纯化抗原。专利技术公开尽管已有教导自分泌运动因子在人组织或体液中存在的浓度因各种疾病而变动的报道，由于迄今不存在用于定量自分泌运动因子的方法，故没有对其开展详细分析。尽管已经对在变性条件下如在还原剂存在下的自分泌运动因子的有无和存在比等实施了定性分析，由于仍没有能够高效识别并结合以保留其结构和功能的形式而通常存在于身体中的天然形式人自分泌运动因子的抗体，仍没有建立用于定量人自分泌运动因子的通用方法。此外，虽然通过以自分泌运动因子所具有的溶血磷脂酶D活性作为指标而测定该酶活性，将溶血磷脂酶D活性的变化与疾病之间的因果关系进行了分析，但是由于在这样的酶活性测定中获得的测定值包括除人样品中所含自分泌运动因子的溶血磷脂酶D活性以外的其它的溶血磷脂酶D活性，并且在活性测定时使用的溶血磷脂酰胆碱底物以及在酶活性测定时形成的胆碱内在地含于样品中等等，因此将所述方法用作特异性定量自分泌运动因子的标准方法没有足够的可靠性。我们找到了用于高效获得针对天然形式人自分泌运动因子的抗体的方法，并且使用以这种方法所获得的针对天然形式人自分泌运动因子的抗体成功地提供了能够精确定量人自分泌运动因子的测定方法和定量试剂，其中所述的测定方法和定量试剂不受活性测定时成为问题的内在物质影响、并且不需要致使样本变性如通过用还原处理法变性或使用蛋白质变性剂如盐酸胍或脲变性的预处理。具体地，本申请包括以下专利技术：(1)特异性识别未受到变性的、在生物体内的存在状态中的天然形式人自分泌运动因子的抗体的筛选方法，该方法包括以下步骤：将能够捕获该抗体的候选抗体的结合因子结合在固相上；将该抗体的候选抗体与所述结合因子结合；使天然形式人自分泌运动因子在已经使所述候选抗体作用的体系中作用；和以天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力作为指标，选择特异性识别该天然形式人自分泌运动因子的抗体。(2)(1)的方法，其中所述结合因子是抗体；(3)(1)或(2)的方法，其中所述天然形式人自分泌运动因子是具有多聚组氨酸标签的重组人自分泌运动因子抗原；(4)(3)的方法，其中所述天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力通过利用特异性结合具有多聚组氨酸标签的所述重组人自分泌运动因子抗原的经标记的抗多聚组氨酸抗体而测定；(5)(4)的方法，其中所述经标记的抗多聚组氨酸抗体是酶标记的抗多聚组氨酸抗体。(6)特异性识别未受到变性的、在生物体内的存在状态中的天然形式人自分泌运动因子的抗体，所述抗体能够通过包括以下步骤的方法取得：将能够捕获该抗体的候选抗体的结合因子结合在固相上；将该抗体的候选抗体与所述结合因子结合；使天然形式人自分泌运动因子在已经使所述候选抗体作用的体系中作用；和以天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力作为指标，选择特异性识别该天然形式人自分泌运动因子的抗体。(7)(6)的抗体，其中所述结合因子是抗体。(8)(6)或(7)抗体，其中所述天然形式人自分泌运动因子是具有多聚组氨酸标签的重组人自分泌运动因子抗原；(9)(8)的抗体，其中所述天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力通过利用特异性结合具有多聚组氨酸标签的所述重组人自分泌运动因子抗原的经标记的抗多聚组氨酸抗体而测定。(10)(9)的抗体，其中所述经标记的抗多聚组氨酸抗体是酶标记的抗多聚组氨酸抗体。根据如上本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性识别未受到变性的、在生物体内的存在状态中的天然形式人自分泌运动因子的抗体的筛选方法，该方法包括以下步骤：　将能够捕获该抗体的候选抗体的结合因子结合在固相上；　将该抗体的候选抗体与所述结合因子结合；　使天然形式人自分泌 运动因子在已经使所述候选抗体作用的体系中作用；和　以天然形式人自分泌运动因子对所述抗体的结合力作为指标，选择特异性识别该天然形式人自分泌运动因子的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2006-8-3 212275/2006;JP 2007-3-30 092412/20071.用于测定人样品中自分泌运动因子的浓度的试剂在制备用于滤泡性淋巴瘤的检查的测定试剂中的用途，其中在所述测定值显示比由源自正常健康受试者的测定值组成的正常值显著更高值的情况下判定是滤泡性淋巴瘤，其中人样品是人血清。2.权利要求1所述的用途，其中根据权利要求1的自分泌运动因子是全长自分泌运动因子、部分切割的自分泌运动因子或部分基因突变的自分泌运动因子。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂是抗体，并且使用抗体的免疫化学测定法测定自分泌运动因子浓度。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：青木淳賢，新井洋由，矢冨裕，池田均，中村和宏，五十嵐浩二，井手和史，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]