检测核酸的系统和方法技术方案

本发明专利技术描述了检测样品中靶核酸的方法和试剂盒。待分析的样品可以包括与靶核酸的至少一部分杂交的引物、具有与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和具有可检测标记的第二区域的探针、延伸杂交的引物的聚合酶以及包含能切割杂交的杂交探针由此产生标记的探针片段的核酸外切酶活性的酶。杂交探针的至少一部分与其另一部分杂交由此形成折叠结构。该方法包括解链样品、降低样品的温度以便使引物和探针与样品中单链靶核酸的至少一部分各自杂交、延长引物以及释放标记的探针片段。可将样品与包含与标记的探针片段杂交的表面结合捕获探针的固相支持体接触。随后检测标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请一般涉及检测生物分子的方法和系统，特别是涉及检测样品中核酸的方法 和系统。
技术介绍
核酸的扩增可以与多种测定联合进行。此类测定可以是定性的，例如当用于评估 生物样品时。然而，通过检测靶核酸的扩增，可改善多种生物学应用，而无需麻烦的印迹技 术或光学方法通常所需的昂贵且易损坏的设备因此，仍然需要改进检测样品中核酸的方法。专利技术概述根据第一实施方案，提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括通过将样品加热至第一温度，解链样品，其中样品包含与靶核酸的至少一部分杂交的引物；包含第一和第二区域的杂交探针，其中第一区域与靶核酸的至少一部分杂交，且 第二区域不与靶核酸杂交，且其中第二区域包含可检测的标记；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交 的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测 标记的探针片段；和其中，第一温度高于引物和存在于样品中的双链核酸的Tm ；随后，通过将温度降至低于第一温度的第二温度，将样品退火，以便使引物和杂交 探针与样品中靶核酸的单链部分各自杂交；和随后，通过使聚合酶在第三温度下延伸与靶核酸杂交的引物，延长引物；使酶的核酸外切酶活性切割杂交探针，由此释放探针片段；任选地重复解链、退火和延长至少一次；将样品与固相支持体的表面接触，其中固相支持体的表面包含一个或多个与探针 片段第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；使捕获探针在第四温度下与存在于样品中的探针片段的至少一部分杂交，其中第 四温度低于第二和第三温度；以及检测固相支持体表面上的标记；其中杂交探针的至少一部分与杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且 其中，所述折叠结构的解链温度(Tm)低于第三温度但高于第四温度。根据第二实施方案，提供了检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含杂交探针，其包含与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第 二区域，其中第二区域不与靶核酸杂交，且其中，当与靶核酸杂交时，核酸外切酶能够切割 杂交探针，由此产生包含第二区域和可检测标记的探针片段；固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与探针片段的 第二区域杂交；任选地，引物，其与靶核酸的至少一部分杂交；以及任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针方向上延 伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和 可检测标记的探针片段；其中，所述杂交探针的至少一部分与该杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠 结构，且其中折叠结构的解链温度(Tm)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链 体的解链温度，且高于探针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。附图简要说明本领域技术人员能够理解下文所述的附图仅仅是出于示例的目的。所述附图并非 是用来以任何方式限制本文教义的范围。图IA是设计使用能形成折叠结构的杂交探针的测定的组成和步骤的示意图，其 中可将杂交探针可与靶序列杂交，杂交的探针的一部分经切割形成标记的探针片段，且其 中可在表面(如利用电极表面)上捕获和检测标记的探针片段。图IB是显示预测的Tm为61. 7°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解。图2是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图IB所示的核苷酸序列的杂 交探针在不同的时间和温度下经40个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) 循环后产生的。图3A是显示预测的Tm为43. 9°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解。图3B是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图3A所示的核苷酸序列的 杂交探针产生的。图4是显示预测的、为34. 2°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该杂交 探针与图3A所示的探针的差异在于从图3A所示的探针中移除了 6个3’核苷酸。图5A是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图5B是显示由具有图4所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图6A是显示预测的Tm为53. 1°C的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该探 针与图3A所示的探针的预测的3’端6个碱基双链区域相比，具有预测的3’端9个碱基的 双链区域。图6B是显示由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图6C是显示由具有图6A所述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状 图。图7A是显示由具有下述核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图GTTACTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT (SEQ ID NO. 5)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的19mer (链节)核苷酸序列。图7B是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图CTTCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 6)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的15mer核苷酸序列。图7C是显示由具有下述的核苷酸序列的杂交探针产生的电化学信号的柱状图TCGTTCGATTG TC ▼ TGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGT(SEQ ID NO. 7)其中该探针具有与靶核酸的靶序列不互补的13mer核苷酸序列。图8A是显示用于禽流感的杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有 44.0°C的预测的Tm。图8B是显示由具有图8A所示的核苷酸序列的禽流感DNA杂交探针产生的PCR后 电化学信号的柱状图。图9A是显示用于禽流感的第二杂交探针的预测折叠结构的图解，所述探针具有 45.3°C的预测的Tm。图9B是显示由具有图9A所示的核苷酸序列的第二禽流感DNA杂交探针产生的 PCR后电化学信号的柱状图。附图说明图10是显示杂交探针的示意图，其中折叠结构是分子内三链体。图IlA和IlB是显示碱基配对结构的图解，所述碱基配对当具有质子化的胞嘧啶 (C+)核碱基的三链体形成时(图11A)以及当用假异胞嘧啶核碱基(pseudoisocytosine nucleobase，也称为J或J碱基)取代质子化的胞嘧啶核碱基时(图11B)发生。图12是密封的电化学室的示意图，其可用于测量温度的升高。各种实施方案的描述出于解释本说明书的目的，使用下列定义，且只要适当，以单数使用的术语也包括 复数，反之亦然。当下文阐述的任何定义与该词语在任何其他文献包括以参考方式并入本 文的任何文献中的用法矛盾时，出于理解本说明书和其相关的权利要求的目的，以下文阐 述的定义为准，除非明确规定了相反的含意(例如为了理解最初使用术语的文献)。除非另 有说明或者使用“和/或”明显不合适，本文中“或”意指“和/或”。除非另有说明或者使用 “一个或多个”明显不合适，本文中“a”意指一个或多个(one or more)。“包含(comprise) ”、 “包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括(includes) ”以及“包 括(including)”可交换使用，且并非意图限制。此外，如果一个或多个实施方案的描述使 用了术语“包含(comprisi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-12-29 60/877,611检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括通过将所述样品加热至第一温度，使所述样品解链，其中所述样品包含与所述靶核酸的至少一部分杂交的引物；包含第一和第二区域的杂交探针，其中所述第一区域与所述靶核酸的至少一部分杂交，且所述第二区域不与所述靶核酸杂交，且其中所述第二区域包含可检测标记；和聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中所述聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交的探针，由此释放包含所述探针第二区域和所述可检测标记的探针片段；和其中所述第一温度高于所述引物和存在于所述样品中的双链核酸的Tm；随后，通过将温度降低至低于所述第一温度的第二温度，使所述样品退火，以便使所述引物和所述杂交探针与所述样品中的靶核酸的单链部分各自杂交；和随后通过使所述聚合酶在第三温度下延伸与所述靶核酸杂交的引物，延长所述引物；使所述酶的核酸外切酶活性切割所述杂交探针，由此释放所述探针片段；任选地重复解链、退火和延长至少一次；将所述样品与固相支持体的表面接触，其中所述固相支持体的表面包含一个或多个与所述探针片段的第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；使所述捕获探针在第四温度下与存在于所述样品中的所探针片段的至少一部分杂交，其中所述第四温度低于所述第二和第三温度；以及检测所述固相支持体表面上的标记；其中所述杂交探针的至少一部分与所述杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中所述折叠结构的解链温度(Tm)低于所述第三温度且高于所述第四温度。2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶和所述具有核酸外切酶活性的酶是同一 分子。3.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(Tm)是41°C至66°C。4.如权利要求1所述的方法，其中所述折叠结构的解链温度(Tm)是58°C至63°C。5.如权利要求1所述的方法，其中在相应折叠结构中，所述捕获探针基本上接触不到 所述探针片段中与所述捕获探针杂交的的第二区域。6.如权利要求1所述的方法，其中所述第三温度高于或等于所述第二温度且小于所述 第一温度。7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二温度和所述第三温度相同。8.如权利要求1所述的方法，其中所述杂交探针还包含邻近所述第一区域且与所述第 二区域相对的第三区域，其中所述第三区域不与所述靶核酸杂交。9.如权利要求8所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域和第三区域都与所述杂 交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。10.如权利要求8所述的方法，其中所述第三区域的至少一部分与所述第二区域的至 少一部分杂交以形成所述的折叠结构。11.如权利要求5所述的方法，其中将所述杂交探针的第二区域的至少一部分与所述 杂交探针的另一部分杂交以形成所述的折叠结构。12.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是热稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：维萨里昂埃瓦萨韦利，克瑞斯蒂恩斯卡博，尤金斯拜尔，
申请(专利权)人：应用生物系统公司，
类型：发明
国别省市：US