一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法，提取方法为：（１）将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织，加Ａ缓冲液，用匀浆器研磨；（２）离心；（３）取上清液，离心，弃上清液，向沉淀中加入Ｂ缓冲液，摇匀后离心，弃去上清液；（４）向沉淀中加入Ｃ缓冲液，提取，然后摇匀，离心，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；本发明专利技术提取和纯化ＴＲＡｂ检测中最为关键的组分ＴＳＨ受体，并对提取和纯化的技术工艺进行了较大的调整和改进，能很好地保持猪ＴＳＨ受体的生物学活性。本提取及纯化方法产率高，克服了以往ＴＳＨ受体只能粗提而不易获得纯品及活性较低的困难。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体地说涉及一种促甲状腺素受体(TSH Receptor, TSHR)的提取及纯化方法。
技术介绍
促甲状腺激素受体自身抗体由甲状腺内的淋巴细胞所产生，是直接作用于甲状腺 细胞膜上的TSH受体的抗体。根据其作用可分为以下三类(1)甲状腺刺激性抗体(TSAb)， 又称甲状腺刺激免疫球蛋白(TSI)，与甲状腺滤泡膜上的TSH受体结合，刺激甲状腺肿大， 增强其功能活性，是导致Garves病(毒性弥漫性甲状腺肿)的主要病因。( 甲状腺抑制 性抗体(TBIAb)，又称甲状腺功能抑制性免疫球蛋白(TBII)，与促甲状腺素受体结合后，可 抑制甲状腺功能，引起甲低。⑶甲状腺生长刺激免疫球蛋白(TGI)，可刺激甲状腺肿大，但 不影响其功能。已知TSAb等刺激性抗体是Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)发生、发展的主要 原因；而TBIAb在甲状腺功能减退症的发病机理中起重要作用，导致甲状腺功能低下。TSAb 作用于TSH受体，模仿TSH的作用，通过环磷腺苷的介导，使T3、T4合成、分泌增加；TBIAb 影响TSH和TSAb对甲状腺的刺激效应，或直接阻断环磷腺苷的释放，从而抑制甲状腺的生 长和功能，导致甲状腺功能减退。文献认为，以上多种不同效应的TRAb之间存在着相对平 衡，一旦平衡被破坏，即由起主导作用的抗体决定临床症状。未经治疗的Graves病患者血 清TRAb (促甲状腺素受体自身抗体)的阳性率可达70%以上。因此，测定血清TRAb对甲亢 和Graves病的病因诊断及鉴别诊断均有重要意义。而获取高纯度、高特异性的TSH受体对 TRAb检测方法的建立起着至关重要的作用。TSH受体存在于甲状腺腺泡上皮细胞，是一种跨膜蛋白。它是含有750个氨基酸残 基，分子量为85000。TSH与其受体结合后，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶，使cAMP (环化腺 苷酸)生成增多，进而促进甲状腺激素的释放与合成。由于膜蛋白水性强、难溶于水，抽提 时既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又要使它保持硫水基在外的天然状态，且TSH受体极 不稳定，其活性很容易降低乃至丧失，分离纯化难度较大。因此以往只能对TSH受体进行粗 提而无法获得纯品，且活性较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种促甲状腺素受体的提取方法。本专利技术的第二个目的是提供一种促甲状腺素受体的纯化方法。本专利技术的技术方案概述如下一种促甲状腺素受体的提取方法，包括如下步骤(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织100 200g，加300 600ml 2_8°C A缓冲 液，用勻浆器研磨3 IOmin ；(2) 1000 2000r/min 离心 20 40min ；(3)取上清液，在2 8°C下8000 18000r/min离心0. 5 1.0小时，弃去上清 液，向沉淀中加入100 200ml B缓冲液，摇勻后2 8°C下50，000 100，OOOg离心0. 5 1.5小时，弃去上清液；(4)向沉淀中加入100 200ml C缓冲液，2_8°C下提取1 2小时，然后摇勻，在 2-8°C下50，000 100，OOOg离心0. 5 1. 5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；所述A缓冲液由下述组份组成0. 2 0. 4M蔗糖；pH = 7. 5的0. 05 0. IM三羟 甲基氨基甲烷-盐酸；100 150mM氯化钠；1. 0 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮 抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟；余 量为水；所述B缓冲液由下述组份组成pH = 7. 5的10 20mM 4_羟乙基哌嗪乙磺酸；质 量浓度为1 2%的甘油；质量浓度为0. 1 0. 2%的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基 醚；1. O 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；所述C缓冲液由下述组份组成pH = 7. 5的10 20mM 4_羟乙基哌嗪乙磺酸；质 量浓度为1 2%的甘油；质量浓度为0.5 1.5%的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯 基醚；质量浓度为0. 5 1. 5 %的正-辛基-β -D-葡萄糖；1 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟，余量为水。一种促甲状腺素受体的纯化方法，包括如下步骤(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织100 200g，加300 600ml 2_8°C A缓冲 液，用勻浆器研磨3 IOmin ；(2) 1000 2000r/min 离心 20 40min ；(3)取上清液，在2 8°C下8000 18000r/min离心0. 5 1. O小时，弃去上清 液，向沉淀中加入100 200ml B缓冲液，摇勻后2 8°C下50，000 100，OOOg离心0. 5 1.5小时，弃去上清液；(4)向沉淀中加入100 200ml C缓冲液，2_8°C下提取1 2小时，然后摇勻，在 2-8°C下50，000 100，OOOg离心0. 5 1. 5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；所述A缓冲液由下述组份组成0. 2 0. 4M蔗糖；pH = 7. 5的0. 05 0. IM三羟 甲基氨基甲烷-盐酸；100 150mM氯化钠；1. O 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮 抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟；余 量为水；所述B缓冲液由下述组份组成pH = 7. 5的10 20mM 4_羟乙基哌嗪乙磺酸；质 量浓度为1 2%的甘油；质量浓度为0. 1 0. 2%的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基 醚；1. O 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；所述C缓冲液由下述组份组成pH = 7. 5的10 20mM 4_羟乙基哌嗪乙磺酸；质 量浓度为1 2%的甘油；质量浓度为0.5 1.5%的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为0. 5 1. 5%的正-辛基-β -D-葡萄糖；1 2mM乙二胺四乙酸；0. 5 1. Oug/ml亮抑酶肽；0. 5 1. Oug/ml抑肽素；0. 6 1. 2ug/ml抑肽酶；0. 1 0. 2mM苯甲基磺酰氟，余量为水；(5)脱盐处理将促甲状腺素受体粗品溶液上PD-IO柱，在10 20mM三乙醇胺缓 冲液的洗脱下脱盐；(6)浓缩处理用高压层析系统对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液进行离子交 换色谱，浓缩纯化，用O 0. 6M的NaCl进行梯度洗脱；(7)高压液相色谱纯化将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪 进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。本专利技术利用独特的蛋白提纯技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促甲状腺素受体的提取方法，其特征是包括如下步骤：（１）将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织１００～２００ｇ，加３００～６００ｍｌ　２－８℃Ａ缓冲液，用匀浆器研磨３～１０ｍｉｎ；（２）１０００～２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０～４０ｍｉｎ；（３）取上清液，在２～８℃下８０００～１８０００ｒ／ｍｉｎ离心０．５～１．０小时，弃去上清液，向沉淀中加入１００～２００ｍｌ　Ｂ缓冲液，摇匀后２～８℃下５０，０００～１００，０００ｇ离心０．５～１．５小时，弃去上清液；（４）向沉淀中加入１００～２００ｍｌ　Ｃ缓冲液，２－８℃下提取１～２小时，然后摇匀，在２－８℃下５０，０００～１００，０００ｇ离心０．５～１．５小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；所述Ａ缓冲液由下述组份组成：０．２～０．４Ｍ蔗糖；ｐＨ＝７．５的０．０５～０．１Ｍ三羟甲基氨基甲烷－盐酸；１００～１５０ｍＭ氯化钠；１．０～２ｍＭ乙二胺四乙酸；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ亮抑酶肽；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ抑肽素；０．６～１．２ｕｇ／ｍｌ抑肽酶；０．１～０．２ｍＭ苯甲基磺酰氟；余量为水；所述Ｂ缓冲液由下述组份组成：ｐＨ＝７．５的１０～２０ｍＭ　４－羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为１～２％的甘油；质量浓度为０．１～０．２％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；１．０～２ｍＭ乙二胺四乙酸；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ亮抑酶肽；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ抑肽素；０．６～１．２ｕｇ／ｍｌ抑肽酶；０．１～０．２ｍＭ苯甲基磺酰氟；余量为水；所述Ｃ缓冲液由下述组份组成：ｐＨ＝７．５的１０～２０ｍＭ　４－羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为１～２％的甘油；质量浓度为０．５～１．５％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为０．５～１．５％的正－辛基－β－Ｄ－葡萄糖；１～２ｍＭ乙二胺四乙酸；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ亮抑酶肽；０．５～１．０ｕｇ／ｍｌ抑肽素；０．６～１．２ｕｇ／ｍｌ抑肽酶；０．１～０．２ｍＭ苯甲基磺酰氟，余量为水。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王立凯，潘学继，李杰，刘贺军，杨斌，张超，王逸尘，陈鹿弛，王凯，
申请(专利权)人：天津市协和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]