一种人体外自身抗体放射免疫定量检测方法技术

一种人体外自身抗体的定量检测方法，属于生物医学技术领域。巧妙利用葡萄球菌蛋白Ａ（ＳＰＡ）能与人和小鼠体内ＩｇＧ的Ｆｃ位点发生反应的共性，利用高亲和力、高特异性的单克隆抗体配制标准品以建立标准曲线，使单克隆抗体和样品中的自身抗体分别与标记抗原反应，用ＳＰＡ包被的纳米磁颗粒作为配体进行固液分离，通过［１２５］↑Ｉ的放射性检测，建立自身抗体的放射配体免疫定量分析方法。本发明专利技术适用于所有自身抗体的定量检测，解决了大多数自身抗体无法准确定量检测的难题，同时避免了交叉反应，也不会出现假阴性或假阳性现象。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
检测方法，是一种用于人体外自身抗体定量检测的放射 配体(纳米磁颗粒)定量分析方法即
技术介绍
自身抗体是指抗自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存 有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、 成分不发生免疫反应。一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为"异 物"，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体， 但不会发生疾病。但如果自身抗体的滴度超过某一水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾 病。自身抗体的产生可能是致病抗原(细菌、病毒等)与自身成分之间存在某些相同的分子 结构出现了与自身抗原发生交叉反应的免疫应答；也可能是某些感染因素使自身抗原变 性，免疫系统对这些暴露的新抗原产生自身抗体。 一些特定自身抗体的定量检测对于许多 疾病的诊断、预防、治疗及疗效评价具有十分重要的意义。下面以谷氨酸脱羧酶自身抗体为例做具体说明，谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase, GAD)是人及动物体内抑制神经递质y-氨基丁酸(GABA)的合成酶，y-氨基丁酸有GAD65与GAD67两种形式的同工酶。糖尿病是现代疾病中危害仅次于癌症的第二杀手，i型糖尿病是遗传易感个体通过自身抗原介导的免疫反应所引起胰岛e细胞破坏的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反应关键的始动耙抗原，因此GAD65-Ab是糖尿病 前期个体较特异的免疫指标。由于大多数糖尿病患者的死因来自于疾病的长期并发症和后 遗症，而在糖尿病明确诊断以前，患者的并发症其实早已经开始，80% 90%的胰岛{3细 胞功能丧失，此时各种免疫干预措施均难以奏效，因此防治工作的关键在于早期诊断。所 以应用适当的诊断标准进行早期诊断对糖尿病的预防和控制以及对其并发症的治疗具有 十分重大的意义。总之，定量检测GAD65自身抗体对临床糖尿病的早期诊断、分型及药物 治疗效果的观察具有十分重要的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种自身抗体放射免疫定量检测方法:建立人血清中自身抗体 的快速、准确的定量检测技术平台，可用于多种自身抗体的定量检测。用谷氨酸脱羧酶 Glutonic acid decarboxylase, GAD65自身抗体放射免疫定量检测方法建立举例说明，本方法将放射免疫分析(Radioimmunoassay RIA)定量检测技术与纳米磁颗粒配体技术相结合，是一种基于配体检测原理的直接检测方法，其核心在于巧妙地利用SPA能 与人和小鼠体内的免疫球蛋白IgG的Fc结合位点发生反应的共同特性，用自创SPA包被 纳米磁颗粒配体技术建立自身抗体的配体免疫定量分析方法。下面以GAD65自身抗体 (GAD65-Ab)的定量检测为例作具体说明。首先将蛋白A包被于纳米磁颗粒表面，利用高亲和力、高特异性的单克隆抗体配制标 准品(用以建立标准曲线)，用相对过量的标记抗原+GAD65 (高度纯化的125I-GAD65)分 别与标准品中的GAD65单克隆抗体及血清样品中的GAD65自身抗体结合形成免疫复合体 (GAD65-Ab)-*GAD65。在包被于纳米磁性颗粒表面的蛋白A的参与作用下，形成三明治式 复合体系，原因是蛋白A会被(GAD65-Ab)^GAD65免疫复合体的Fc部分结合。其中蛋白 A部分包被于纳米磁性颗粒表面上，从而形成一个固相，以磁板进行固液相分离，吸去包 含未结合标记物的上清液并洗珠后，直接用Y-计数器检测放射强度(CPM)，根据标准 品的CPM值建立标准曲线，可从标准曲线上査出病人GAD65自身抗体的浓度值。样品或标准品中GAD65-Ab浓度越高则标记物特异性结合越多，因此所检测到的放射 性强度也越强，即放射强度(CPM)是与GAD65-Ab浓度成正比的。在样品中没有GAD65-Ab 情况下无免疫体系形成，因为标记物仅结合GAD65-Ab，而不结合蛋白A。本方法中作为标准品的单克隆抗体与血清样品中的自身抗体并不进入同一反应体系， 只是利用了它们具有与SPA特异结合的共性进行对照，因此不会发生交叉反应，所以检测 效果具有特异性强、灵敏度及准确度高等优点，且不会出现假阴性或假阳性现象。本方法包括以下步骤(一) 试剂盒组成成分GAD65-Ab放射免疫配体定量分析诊断试剂盒主要组分为标记物(125I-GAD65),标 准品(GAD65单抗)，配体试剂(SPA-纳米磁颗粒)，洗涤液。(二) 试剂盒各组分的制备1、 标记抗原的制备采用乳过氧化物酶法标记技术制备125I-GAD65，使其放化纯度达到 95%以上。2、 特异性单克隆抗体的制备用GAD65抗原免疫小鼠，通过细胞融合杂交瘤技术制备 GAD65单克隆抗体(GAD65-Ab),作为绘制参照曲线的标准品。3、 葡萄球菌蛋白A(SPA)—纳米磁颗粒的制备将SPA通过碳二亚胺包被于有机硅烷化磁 性纳米粒子表面，作为进行固液分离的配体试剂。(二 ) GAD65-Ab放射配体(纳米磁颗粒)定量分析方法及临床检测标准的建立。1、 建立人血清中GAD65-Ab的放射配体(纳米磁颗粒)定量分析方法，并制定试剂盒的实验 操作方法及质量控制标准。2、 经大量临床试验结果显示，用本项目完成的试剂盒测定受检者血清中GAD65-Ab的含量， 用以判断糖尿病的诊断及分型，其临床符合率》95%。因此，本试剂盒的GAD65-Ab临床 测定值，可为糖尿病早期诊断及其正确分型，早期干预治疗、正确用药及疗效评价提供可靠依据。 附图说明图1是放化纯度图 图2是结合率图具体实施例方式本方法的内容，通过以下实施例作具体说明GADM自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法的建立(一)试剂盒各组分的制备1、标记抗原(125I-GAD65)的制备(1) 采用改进的乳过氧化物酶法标记技术制备125I-GAD65:称GAD6510 50jig溶于PH6.5磷酸缓冲液50 200pl中，加入Na125I 1 8mCi、乳过 氧化物酶溶液40 150ng C10 5(V1)、过氧化氧(H202) 400 800 ng (50 100nl)， 37°C 温育中，滴加&02400 800 ng (50 100h1)， 5 10分钟内完成，再继续反应2 5分钟 后，加入0.5 2.0ml20mmol/L巯基乙醇30 60秒以终止反应，反应液迅速转移到预先用 PH6.5 7.5磷酸缓冲液平衡的Sephadex G50或Sephadex G25柱上层析分离，以平衡液洗 脱，自动收集，用Y-计数器检测放射强度。收集第一峰。以纸层析法鉴定1251-谷氨酸脱 羧酶(GAD65)的放化纯度，以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定"I-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的化学纯 度。(2) 放化纯度的测定放化纯度指在标记物中结合在抗原上的放射性活度占该标记物总放射性活度的百分 比。我们采用两种方法进行鉴定 a、纸层析法鉴定1) 将lcmxl2cm滤纸浸于P/。KI溶液中过夜备用。2) 使用前将浸过的滤纸吹干，并按每lcm距离用铅笔标出。3) 将待鉴定的标记物5jiL 10nL点样于距端点lcm处，晾干。4) 将已点样的滤纸条放于层析缸内，然后加展开剂。展本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人体外自身抗体放射免疫定量检测方法，用谷氨酸脱羧酶Ｇｌｕｔａｍｉｃ　　ａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＧＡＤ６５自身抗体放射免疫定量检测方法建立举例说明，其特征在于：　　　　本方法将放射免疫分析－Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ＲＩＡ－定量检测技术与纳米磁颗粒配体技术相结合，是一种基于配体检测原理的直接检测方法，其核心在于巧妙地利用ＳＰＡ能与人和小鼠体内的免疫球蛋白ＩｇＧ的Ｆ↓［Ｃ］结合位点发生反应的共同特性，用自创ＳＰＡ包被纳米磁颗粒配体技术建立自身抗体的配体免疫定量分析方法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘学继，
申请(专利权)人：天津市协和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]