人ｍｉＲ－１５０反义核酸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１５０表达的反义寡聚核苷酸及其应用。本发明专利技术所述的反义寡聚核苷酸，包括下述序列：５’－ＣＡＣＵＧＧＵＡＣＡＡＧＧＧＵＵＧＧＧＡＧＡ－３’，上述序列可特异性结合于人ｍｉＲ－１５０。本发明专利技术的反义寡聚核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体，并可以对链中任一核苷酸进行修饰。本发明专利技术所述的ｍｉＲ－１５０反义寡核苷酸能够有效抑制人脑胶质瘤细胞Ｕ８７中ｍｉＲ－１５０的表达，同时抑制上述细胞的生长和增殖，从而能够有效地治疗脑胶质瘤及其他ｍｉＲ－１５０高表达的肿瘤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域。具体地，本专利技术涉及一种小分子Hiicr0RNA(IIiiRNA)的 用途，尤其是涉及到该miRNA的反义寡聚核苷酸的应用。该反义寡聚核苷酸可与人miR-150 互补，从而抑制人miR-150的表达。本专利技术还涉及含有该miRNA反义寡聚核苷酸的药物组 合物。
技术介绍
mi RNAs是小的非编码RNA，长度为20_22bp，通常是由RNA聚合酶II(PolII) 转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。这些pri_miRNA在RNase III Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成 70个核苷酸组成的pre-miRNA前体产物。RAN-GTP和exportin 5将这种前体分子输送到细 胞质中。随后，另一个RNase III Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的双链。这种 双链很快被引导进入(miRISC)复合体中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的单链miRNA 保留在这一复合物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过两种依赖于序列 互补性的机制负调控基因表达，与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其 表达。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制 的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几 乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物种进化中 相当保守，在动物，植物和真菌等中发现的miRNAs表达均有严格的组织特异性和时序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节细胞生 长和组织分化，与生物生长发育有关。一系列的研究表明miRNAs在细胞生长和凋亡，血细 胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎 后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273参与线虫的神经系统发育过程；miR-430 参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物造血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳 动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动 物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮 层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。miRNA表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作 用。最先在B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)中发现有miRNA表达水平的改变，随后陆续在 各种人类肿瘤中均检测到miRNA表达水平的变化。研究发现，miRNAs与肿瘤形成相关，既能 发挥肿瘤抑制基因的作用(如mir-lfe和mir-16-l)，也能起到癌基因的作用(如mir_155 和mir-17-92簇)。目前认为，在肿瘤细胞中，有些miRNA成熟体或前体表达水平异常，而表 达异常的miRNA通过影响靶mRNA翻译发挥作用，参与肿瘤形成过程，并起重要作用。如Ras 原癌基因受let-7家族的调控，BCL2抗凋亡基因受miR-lfe-miR-16-l簇调控，E2F1转录因 子受miR-17-92簇调控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的调控等。miRNAs的表达下调也和肿 瘤发生有密切关系，这预示着miRNA具有癌基因的功能。例如，mir-143和mir_145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明， 可能是由于其加工过程受到破坏。但是，mir-143和mir-145的肿瘤抑制基因功能可能不 仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。 另一个报道表明，miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中表达量比正 常组织高5-100倍。miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基 因。在肿瘤治疗方面，miRNA的应用前景光明。在利用miRNA作为治疗靶点方面，已有实验 数据支持如在吉西他滨(gemcitabine)治疗的过程中，出现miRNA表达谱的变化；调控部 分miRNA的表达水平(如使miR-21过表达)，能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性。通 过引入与具有癌基因特性的miRNA互补的合成的反义寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs，延缓其生长。临床上，可以通过经常的或者持 续的2’ -0-甲基化或者锁核酸(LNA)等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA失活。这些 修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。使用antagomirs (与胆固醇偶联的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成为一种有希望的治疗 药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族也可以用于治疗 某些特定的肿瘤。反义寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer & Metastasis Reviews 1998 ;17(幻169-76)是指一段可以与其靶基因的碱基互补的核苷酸。反义寡聚 核苷酸可以抑制相应基因的表达。近三十年，尽管临床上肿瘤的综合治疗已很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综 合治疗对肿瘤患者的生存率提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在30% 55% 左右，并没有显著提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为20%。而且这些方法都存在各 自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳。因此，寻找更安全有效的治疗途径是提 高肿瘤患者生存率和生存质量所亟待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术要解决的主要问题就是提供一种新的miR-150的反义寡聚核苷酸(抑制 剂)，用于高效、低毒或无毒地抑制miR-150的表达，进而治疗与miR-150过度表达有关的疾 病，包括各种实体肿瘤、各种白血病等。本专利技术要解决的另一问题就是提供上述反义寡聚核苷酸在细胞中抑制miR-150 表达和抑制细胞生长和增殖的应用。本专利技术要解决的再一问题是提供包含上述反义寡聚核苷酸的药物组合物。本专利技术人通过广泛而深入的研究，设计并合成了一种专一性针对miR-150的反义 寡聚核酸，并在培养细胞中验证具有抑制miR-150表达和抑制细胞生长的效果。研究显示， 这些反义核酸能够抑制肿瘤细胞的生长和恶性增殖能力。本专利技术设计了一种可以特异性结合于miR-150的反义核酸分子，在培养细胞U87 中，验证对miR-150表达特异性抑制的反义核酸对细胞生长能力、增殖能力的影响。反义核 酸分子长度可以包含13 22个核苷酸残基，均有不同程度的抑制人肿瘤细胞生长能力、增 殖能力的特性，其中最短的反义核酸长度为13个碱基，不同长度的反义核酸均具有良好的肿瘤细胞生长及增殖抑制活性。因此，上述反义核酸均可用来制备抑制肿瘤细胞生长能力、 增殖能力的制剂，其中优选miR-150高表达的肿瘤细胞。在此基础上完成了本专利技术。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反义寡聚核苷酸，其特征在于所述的反义寡聚核苷酸包含序列５’－ＣＡＣＵＧＧＵＡＣＡＡＧＧＧＵＵＧＧＧＡＧＡ－３’。

【技术特征摘要】
1.一种反义寡聚核苷酸，其特征在于所述的反义寡聚核苷酸包含序列 5 ‘-CACUGGUACAAGGGUUGGGAGA-S，。2.如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于其中的核苷酸为核糖核苷酸、脱 氧核糖核苷酸或者核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。3.权利要求1 2中任一反义寡聚核苷酸的修饰型。4.如权利要求3中所述的寡聚核苷酸，其特征在于所述的化学修饰选自核糖修饰、碱 基修饰或者磷酸骨架修饰中的一种或几种组合。5.如权利要求4中所述的寡聚核苷酸，其特征在于所述的化学修饰选自硫代修饰、 2 ‘甲氧基修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，张佩琢，东楠，李捷，沈孝坤，
申请(专利权)人：苏州吉玛基因药物科技有限公司，中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]