本发明专利技术是一种马铃薯Ｙ病毒烟草分离物不同株系的检测方法。通过马铃薯Ｙ病毒特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯Ｙ病毒、高温变性获得病毒ＲＮＡ作为模板、利用马铃薯Ｙ病毒不同株系外壳蛋白基因简并引物进行一步法反转录聚合酶链式反应（ｏｎｅ?ｓｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ）、利用限制性内切酶ＥｃｏＲ?Ｖ对ＰＣＲ产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。该方法将快速、特异和高灵敏度的免疫捕捉ＲＴ－ＰＣＲ与快捷的ＰＣＲ产物酶切鉴定，从而快速、简便的检测马铃薯Ｙ病毒烟草分离物不同株系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病毒学
，具体是一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物 不同株系的方法。
技术介绍
马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是马铃薯病毒科(Potyviridae)马铃薯Y 病毒属(Potyvirus)的典型成员。在东亚地区、中南美洲、加拿大、墨西哥、哥斯达黎加及美 国均有发生，我国各主要烟区亦普遍发生，该病毒还可侵染茄科、苋科、藜科、菊科和豆科的 120余种植物。马铃薯Y病毒病毒粒子呈弯曲线状，无包膜，长约700nm，直径11 13nm，螺旋对 称结构，可在感病寄主体内形成风轮状内含体。标准沉降常数S20w= 154S，氯化铯中的浮 力密度为1. 33g/cm3。烟叶粗汁液的钝化温度为55°C，10min，稀释限点(DEP)为1X10—4，体 外存活期(LIV) 5 10天。病毒核酸为单分子线形正义ssRNA，长9496nt，基因组结构具有典型马铃薯Y病毒 属病毒结构特征，核酸约占病毒粒子重量的5%。病毒外壳蛋白由一种多肽组成，分子质量 约 30 47kDa。马铃薯Y病毒基因组RNA具有典型的马铃薯Y病毒属病毒基因组结构特征，其5' 端为VPg结构，3'端为Poly(A)尾。基因组编码一个多聚蛋白，切割产生10个蛋白，分别 为Pl蛋白(功能未知)、HC-Pro蛋白(与蚜虫传播相关)、P3蛋白(功能未知)、6K1蛋白 (功能未知)、CI蛋白(柱状内含体蛋白)、6Κ2蛋白(功能未知)、NIa-VPg蛋白(即VPg 蛋白)、NIa-Pro蛋白(核内含体蛋白酶)、NIa蛋白(核内含体复制酶)和外壳蛋白。基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的酶联免疫吸附法和基于病毒核酸的PCR检测 是目前应用最为广泛的检测病毒的方法。免疫捕捉RT-PCR结合了上述两种方法的优点。免 疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)主要由三个部分组成，第一部分的免疫反应类 似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程，第二部分为第一链cDNA的合成，第三 部分即通常的PCR检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种马铃薯Y病毒烟草分离物不同株系的鉴定方法。本专利技术为快速的检测大量样品，将免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR) 主要有三个组成部分，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测 定过程，第二部分的第一链cDNA的合成，第三部分的PCR检测，用一步法反转录聚合酶链式 反应试剂盒将后两步合并为一步。整个技术省略了繁琐的RNA提取、第一链cDNA的合成以 及PCR产物回收、克隆和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤，利用抗体的高效价及特异性， 特异快速的获得目的片段，通过简单的酶切反应鉴定病样中马铃薯Y病毒的不同株系，为 研究病毒的分子变异提供了一种快速、特异和高灵敏度的方法，从而简化了 RT-PCR技术鉴定马铃薯Y病毒的不同株系的方法。本专利技术的技术方案如下1)用马铃薯Y病毒特异抗体诱捕马铃薯Y病毒； 2)高温变性获得病毒RNA作为模板；3)利用马铃薯Y病毒不同株系外壳蛋白基因简并引物进行一步法反转录聚合酶 链式反应；4)利用限制性内切酶EcoR V对PCR产物进行酶切；5)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。结果分析吸附在PCR管壁上的马铃薯Y病毒特异性抗血清能捕捉烟草病样中的 马铃薯Y病毒病毒粒子，一步法反转录聚合酶链式反应(one step RT-PCR)扩增产物经酶 切后得到大小约为260bp和540bp的两条片段或者仅含有一条约SOObp的片段，与报道的 马铃薯Y病毒外壳蛋白基因0株系和C株系(PVY°，PVYe)在病毒核苷酸碱基序列263位置有 一个EcoR V酶切位点相符，而马铃薯Y病毒外壳蛋白基因N株系和NTN株系(PVYn，PVYntn) 在该位置没有EcoR V酶切位点。因此，通过酶切反应可以区分马铃薯Y病毒0株系和C株 系与N株系和NTN株系的差异。未经马铃薯Y病毒抗血清吸附的PCR管中没有扩增到目的 片段。表明IC-RT-PCR方法利用免疫结合原理可以捕捉到病株汁液中微量的病毒，进行PCR 检测，同时利用简单的酶切反应可以快速的鉴定马铃薯Y病毒不同株系。电泳结果中如果含有约260bp和540bp的片段，说明样品中含有马铃薯Y病毒0 株系或C株系，否则含有马铃薯Y病毒N株系或NTN株系。本专利技术的方法将快速、特异和高灵敏度的免疫捕捉RT-PCR与快捷的PCR产物酶切 鉴定，从而快速、简便的检测马铃薯Y病毒烟草分离物不同株系。附图说明图1是检测昭通、玉溪、保山烟草样品中的马铃薯Y病毒不同株系的电泳检测结^ ο具体实施例方式1.引物设计上游引物5‘ -TGCATATGGSAAATGACACAATCGATGCAG-3 ‘下游引物5'-CCAAGCTTCATGTTCTTSACTCCAAGTARA-3'用于扩增马铃薯Y病毒不同株系外壳蛋白基因区域SOlbp片段；2.病毒粒子的免疫捕捉在PCR管中加入稀释为1 5000的马铃薯Y病毒兔多抗血清，4°C下包被过夜后， 吸出PCR管中液体，用含有0. 2%吐温20的磷酸盐缓冲液(0. lmol/L,pH7. 0)洗涤PCR管内 壁3次，吸出PCR管中液体，备用；烟草病样用含有0.2%吐温20的磷酸盐缓冲液(0. Imol/ L，pH7. 0)研磨，IOOOg离心lmin，取100 μ L上清液加入上述PCR管中，温育3h后，吸出PCR 管中液体，用含有0. 2%吐温20的磷酸盐缓冲液(0. lmol/L,pH7. 0)洗涤PCR管内壁3次， 吸出PCR管中液体，再用灭菌的0.2%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水洗涤1次PCR管内壁， 吸出PCR管中液体，短暂离心后，吸净PCR管内的液体。3.高温变性加25 μ L灭菌的0. 2%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水，97°C变性5min,即刻插入冰内放置预冷3-5min ；4. 一步法反转录聚合酶链式反应(one step RT-PCR)应用大连宝生物公司一步法反转录聚合酶链式反应(one step RT-PCR)试剂盒进行RT-PCR反应，反转录聚合酶链式反应反应体系lOXOne-step RT-PCR Buffer5 μ L25mmol/L MgCl210 μ L10mmol/L dNTPs5 μ L5U/μ L AMV Reverse Transcriptase XL1 μ L40U/μ L RNase Inhibitor1 μ L5U/y L AMY-Optimized Taq1 μ L0. 1 μ g/μ L上下游引物各IyL反转录聚合酶链式反应反应条件50°C温育 40min ；94°C变性 3min ；94°C变性 40s，50°C退火 40s，72°C延伸 lmin，反应30循环；72°C延伸lOmin，降至常温；5.酶切反应应用大连宝生物公司EcoR V限制性内切酶进行酶切反应，酶切反应体系10XH Buffer 2μ LPCR 产物 IOyL灭菌超纯水 7 μ LEcoR V限制性内切酶 IyL酶切反应条件37°C酶切4小时；65°C处理lOmin，终止酶切反应，降至常温；6.电泳检测PCR反应结束后取5μ L反应产物进行1. 5%琼脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物不同株系的方法，其特征在于按以下步骤进行1)用马铃薯Y病毒特异抗体诱捕马铃薯Y病毒；2)高温变性获得病毒RNA作为模板；3)利用马铃薯Y病毒不同株系外壳蛋白基因简并引物进行一步法反转录聚合酶链式反应；4)利用限制性内切酶EcoR V对PCR产物进行酶切；5)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。2.根据权利要求1所述的马铃薯Y病毒烟草分离物不同株系的检测方法，其特征在于 诱捕马铃薯Y病毒是在PCR管中加入稀释为1 5000的马铃薯Y病毒兔多抗血清，4°C下包 被过夜后，吸出PCR管中液体，用含有0. 2%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤PCR管内壁3次， 吸出PCR管中液体，备用；烟草病样用含有0. 2%吐温20的磷酸盐缓冲液研磨，IOOOg离心 Imin，取100 μ L上清液加入上述PCR管中，温育3h后，吸出PCR管中液体，用含有0. 2%吐 温20的磷酸盐缓冲液洗涤PCR管内壁3次，吸出PCR管中液体，再用灭菌的0. 2%焦碳酸二 乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：付修庭，张仲凯，丁铭，游堂贵，黄韡，董家红，秦西云，赵声春，方琦，卯志勇，陆文林，张磊，
申请(专利权)人：云南省烟草公司昭通市公司，云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：53
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