本发明专利技术涉及一种基于量子点共振能量转移检测ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变的方法，包括：巯基丙酸ＭＰＡ包裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构量子点的制备；ＨＢＶ ＤＮＡ检测探针的设计及合成；ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物的制备；ＨＢＶ ＤＮＡ临床样本的制备；使用酶标仪对互补的及单碱基突变的ＨＢＶ靶ＤＮＡ的高通量检测。该方法操作简单，不需要对杂交体系中未联接的ＤＮＡ进行分离纯化；由于Ｃｙ５在所选的激发光（４８５ｎｍ）下不会直接产生荧光信号，因此背景干扰小，信号强；该方法还具有特异、快速、高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，可应用于临床医学中ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变的高通量和多靶标的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属靶DNA或单碱基突变的检测领域，特别是涉及一种基于量子点共振能量 转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法。
技术介绍
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)引起的疾病，乙肝病毒的 感染是一个全球性的健康问题。全世界将近有3. 5亿HBV慢性携带者，我国有1. 2亿HBV病 毒携带者，并呈上升趋势。HBV的感染可以引起多种疾病，比如慢性肝炎，肝硬化和原发性 肝癌。在HBV的治疗方面，通过抗HBV药物来抑制病毒复制是目前治疗慢性乙型肝炎(CHB) 最重要和有效的方法。诸如拉米呋啶和阿德福韦等药物已广泛用于抗HBV的治疗。但药 物长期应用后，病毒产生基因突变，进而引发的变异和耐药性问题已成为临床中的棘手问 题。因此，定量检测HBV DNA及碱基突变在HBV基础研究和临床实践中具有重要意义。目前 最常见的检测HBV感染及单碱基突变的方法包括凝胶电泳聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、分支 DNA 信号扩增法(branched DNA signal ampli-f ication assay)、等位特异的 DNA 杂交方法(allele-specif ic DNA hybridization)、连接或 引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信标的荧光共振能量转移 (molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer),电化学检 贝Ij (electroche mical detect-ing)等。但这些方法普遍存在一些缺陷，或者操作过程复杂， 或者灵敏度不高，或者比较费时，缺乏多靶标高通量检测的能力。因此建立简单、特异、快速 和高通量的靶DNA及单碱基突变检测的方法是解决临床应用的关键问题。量子点(quantum dots，QDs)，是一种新型的荧光探针。自从第一批报道使用修饰 的CdSe/ZnS核/壳结构QDs作为荧光标记物标定生物样品以来，QDs近年来已在众多的生 物分析和生理过程研究中引起广泛的关注和应用。QDs具有许多独特的光物理性质，如宽 广的吸收光谱和狭窄的发射光谱，这使得它们可以作为良好的能量供体应用于基于荧光共 振會邑量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的传感器中。这是因为这 些荧光特性允许我们能够在QDs宽广的吸收光谱中选择某个激发波长进行激发，从而避免 对染料受体(如Cy5)的直接激发；并可以选择适当的滤光片对供体和受体发射的荧光进 行有效的分离。迄今为止，研究者们已构建了多种以FRET为基础的QDs纳米传感器。这些 传感器已被成功用于多种分析物的检测，包括营养物质、爆炸物、蛋白质、酶以及PH值的变 化等。与此同时，也有研究集中在基于FRET的QDs-DNA纳米传感器应用于寡核苷酸(DNA) 的识别，通过寡核苷酸杂交后引起的FRET荧光发射信号的变化从而达到对寡核苷酸(DNA) 的识别和检测。但是许多QDs-DNA传感器的制备过程复杂，代价高，而且制备得到的探针不 能够长期保存。绝大多数情况下，构建的QDs-DNA FRET传感器是在常规的荧光仪上实现对 靶DNA的检测的，但是利用普通荧光仪进行检测的方法通常都比较繁琐和费时。也有一些 研究者通过将QDs植入到纳米管上或者结合单分子荧光检测技术，可以获得检测灵敏度很高的DNA传感器，然而这些方法中传感器制备过程的复杂性，以及需要精贵复杂的仪器，都 使得这些方法的应用受到了限制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于量子点荧光共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，以解决现有技术中的缺陷。本专利技术的一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包 括(一 )检测探针的制备及HBV DNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0. 5mL荧光发射峰为575 615nm的三辛基氧化磷(TOPO)包裹的CdSe/ZnS核 /壳结构QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巯基丙酸(MPA)溶液，室 温搅拌30 60分钟，加入5 SmL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉 淀后，将得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnSQDs ；(2) HBV DNA检测探针的设计及合成HBV多聚酶位点rtM204I/V(YMDD)的变异与血清中HBV DNA的反弹及转氨酶水平 有关。当M变为V或I时可导致氨基酸侧链的柔性减低，并在HBV聚合酶和拉米呋啶三磷酸 盐之间形成空间位阻，使其与拉米呋啶三磷酸的结合力下降，导致病毒对拉米呋啶的耐药。 本专利技术根据YMDD (rtM204M)及变异型YVDD (rtM204V)的DNA序列设计检测探针，其中每个 位点设计两个相连接的探针，两个探针的长度都是15个碱基，单碱基多态位点设计在第一 个探针的3’端，并在5’端修饰Cy5(为信号探针)，另一个探针将用作QDs-DNA交联探针， 探针的3’未端经过氨基功能化修饰，以便与修饰了羧基的量子点结合，所有用到的DNA序 列见表1，探针的合成由大连宝生物(TAKARA)有限公司完成；表1. HBVDNA靶序列及探针权利要求1. 一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括(一)检测探针的制备及HBVDNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0. 5mL荧光发射峰为575 615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/壳结 构QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巯基丙酸MPA溶液，室温搅拌 30 60分钟，加入5 SmL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将 得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs ；(2)HBV DNA扩增引物及检测探针的设计合成 PCR扩增引物PCR 上游引物5’ -ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC-3’ ； PCR 下游引物5，-CAGAGCAGAGGCGGTGTCG-3，； 检测探针-NH2 修饰的单链 DNA 探针5，-TGG ATG ATG TGG TAT (T)10(CH2)3- (NH2) -3'； -Cy5 标记的信号 DNA 探针-1 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATA-3，； -Cy5 标记的信号 DNA 探针-2 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATG-3，；(3)QDs-DNA探针交联物的制备将0. 5g/L的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC、0. 5g/L的N-羟基琥珀 酰亚胺NHS和0. 05 μ M的MPA包裹的QDs按体积比为1 2 1 2 2 6的比例混合， 活化0. 5 2小时，然后加入上述-NH2功能化修饰过的单链DNA探针，于37°C孵化0. 5 2小时，制备得到QDs-D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于量子点共振能量转移检测ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变的方法，包括：（一）检测探针的制备及ＨＢＶ ＤＮＡ临床样本的制备（１）巯基丙酸包裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构量子点的制备取０．５ｍＬ荧光发射峰为５７５～６１５ｎｍ的三辛基氧化磷ＴＯＰＯ包裹的ＣｄＳｅ／ＺｎＳ核／壳结构ＱＤｓ的甲苯溶液，加入２～４ｍＬ氯仿，再逐滴加入２～４ｍＬ巯基丙酸ＭＰＡ溶液，室温搅拌３０～６０分钟，加入５～８ｍＬ水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的ＱＤｓ溶于Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超纯水中，制备得到ＭＰＡ包裹的水溶性ＣｄＳｅ／ＺｎＳ ＱＤｓ；（２）ＨＢＶ ＤＮＡ扩增引物及检测探针的设计合成ＰＣＲ扩增引物：ＰＣＲ上游引物：５’－ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＴＴＣ－３’；ＰＣＲ下游引物：５’－ＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＧＴＧＴＣＧ－３’；检测探针：－ＮＨ↓［２］修饰的单链ＤＮＡ探针：５’－ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＴＡＴ（Ｔ）１０（ＣＨ↓［２］）↓［３］－（ＮＨ↓［２］）－３’；－Ｃｙ５标记的信号ＤＮＡ探针－１：５’－Ｃｙ５－ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＴＡ－３’；－Ｃｙ５标记的信号ＤＮＡ探针－２：５’－Ｃｙ５－ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＴＧ－３’；（３）ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物的制备将０．５ｇ／Ｌ的１－乙基－３－（３－二甲基氨丙基）－碳化二亚胺ＥＤＣ、０．５ｇ／Ｌ的Ｎ－羟基琥珀酰亚胺ＮＨＳ和０．０５μＭ的ＭＰＡ包裹的ＱＤｓ按体积比为１～２∶１～２∶２～６的比例混合，活化０．５～２小时，然后加入上述－ＮＨ↓［２］功能化修饰过的单链ＤＮＡ探针，于３７℃孵化０．５～２小时，制备得到ＱＤｓ－ＤＮＡ探针交联物；（４）ＨＢＶ ＤＮＡ临床样本的制备采用裂解法抽提阳性血清样品中ＨＢＶ基因组ＤＮＡ，然后对ＨＢＶ ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，制得ＨＢＶ ＤＮＡ临床待测样本；（二）使用酶标仪对互补靶ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变的检测（１）互补靶ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变的检测将１０μＬ的ＨＢＶ ＤＮＡ的ＰＣＲ待测样本加入到１１５μＬ（２０ｍＭ）的Ｔａｑ联接缓冲液中，在ＰＣＲ仪上经９５℃变性５分钟，使其解为单链；随后将该混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴５分钟；然后向该混合液中加入７０μＬ上述（一）／（３）中的ＱＤｓ－ＤＮＡ探针、１０μＬ的Ｃｙ５标记的信号探针－１（１０μＭ）、５μＬ（１个单位）的Ｔａｑ ＤＮＡ联接酶；将该混合液共２１０μＬ于４２℃下反应１５～３０分钟，在联接反应完成后，将该反应混合液于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ仪上在８５℃下加热变性５分钟，使双链解离变为单链；变性后，立即将反应混合液置于冰水中冰浴５分钟；冰浴后将反应混合液迅速转移至９６孔板酶标仪中，在Ｗａｌｌａｃ １４２０型酶标仪上采用４８５ｎｍ光激发，检测杂交反应液６７０ｎｍ处的荧光发射强度，从而实现对完全互补的或单碱基突变的ＨＢＶ ＤＮＡ临床样本的检测；（２）互补靶ＨＢＶ ＤＮＡ及单碱基突变检测的结果判断①基于ＱＤｓ－Ｃｙ５荧光共振能量转移的ＨＢＶ ＤＮＡ野生型的定量检测将上述（二）／（１）中６７０ｎｍ处荧光发射强度的检测结果与不加ＰＣＲ待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若上述（１）中６７０ｎｍ处的荧光发射强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的ＨＢＶ ＤＮＡ未发生突变，即为野生型，这时可将该样本于６７０ｎｍ处的荧光发射强度与标准曲线进行对比，可以确定样本中ＨＢＶ ＤＮＡ的浓度，从而实现了对野生型ＨＢＶ ＤＮＡ的定量检测；②基于ＱＤｓ－Ｃｙ５荧光共振能量转移的ＨＢＶ ＤＮＡ单碱基突变的检测将上述（１）中６７０ｎｍ处荧光发射强度的检测结果与不加ＰＣＲ待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度与空白噪声的荧光强度相当，则判断该样本中的ＨＢＶ ＤＮＡ发生了单碱基突变；③ＨＢＶ单碱基突变样本的突变类型的判断替换步骤（二）／（１）中的待测样本为上述②中的ＨＢＶ ＤＮＡ的单碱基突变样本，并将该步骤中的Ｃｙ５标记的信号探针－１替换为Ｃｙ５标记的信号探针－２，其他方法相同进行检测；将突变样本于６７０ｎｍ处荧光发射强度的检测结果与不加ＰＣＲ待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的ＨＢＶＤＮＡ发生了ＹＶＤＤ突变，反之则为其他突变。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛红菊，王祥，钟新华，赵建龙，金庆辉，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31
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