一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术为一种单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）基因分型检测方法及试剂盒，它采用基于ＨＳＶ　ＤＮＡ聚合酶基因设计的引物探针，利用ＴａｑＭａｎ探针多波长荧光ＰＣＲ技术在单管中同时检测ＨＳＶ　１型和２型，以不同波长扩增模板的荧光信号和循环阈值判断样本中ＨＳＶ的存在和型别。试剂盒还使用了人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性。试剂盒组分包括核酸提取液、ＰＣＲ缓冲液、荧光探针、Ｔａｑ酶、内参照、阴性及阳性对照；其使用包括样本处理和扩增检测两步骤。试剂盒操作简便，灵敏度高，不仅可避免自身ＰＣＲ产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中ＰＣＲ抑制剂引起的假阴性问题，可广泛应用于临床中该病原体的基因分型快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种利用荧光PCR技术对单纯疱疹病毒进行基因分型的方法与试剂盒ο
技术介绍
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Viruses, HSV)属疱疹病毒科，病毒颗粒直径 约180nm，具双链DNA，根据其抗原性的差别和DNA序列限制内切酶切点不同，分HSV-I和 HSV-2两型，并且已经完成HSV-I和HSV-2的基因组测序。临床上HSV可引起颜面和口唇 部位的疱疹(颜面疱疹，如"口疮")，或生殖器部位的疱疹(生殖器疱疹)等，生殖器官 以外部位的HSV感染多由HSV-I型引起(占95% )，而生殖器官的HSV感染主要由HSV-2 型引起(占78%)，但是两种类型的HSV均能感染这两个部位，也均能够感染新生儿。一般 HSV可在分娩时通过产道感染给新生儿，引起新生儿疱疹，导致皮肤、眼或口腔感染，损害中 枢神经系统和其它内脏器官，导致智力缺陷，甚至死亡(死亡率高达50%，幸存者中多有智 力发育障碍)。人体是HSV的唯一天然宿主，它可在人体内终生潜伏、在适当条件下被激活 后能引起复发感染。近年来，在全球范围内HSV-2型的流行率持续上升，而生殖器疱疹虽然 以HSV-2为主，但HSV-I也在日益增多。HSV检测既是临床妇女孕期优生优育五项(TORCH) 检测的项目之一，又是性传播疾病控制预防中的一个令人关注的公共卫生问题。另外，HSV 检测的同时如果能明确所感染的基因型，将在短期内为HSV感染疾病的治疗提供有益的信 息帮助。目前HSV的实验室常规诊断采用酶联免疫(ELISA)方法，另外还有金标抗原、聚合 酶链反应(PCR)等方法。而HSV的基因分型方法通常采用分子生物学方法，例如链取代反 应(SDA)和PCR技术，目前国外已有商业化的HSV基因分型检测试剂盒用于科研或临床诊 断，包括美国BD公司、罗氏公司及德国QIAGEN的HSV- Λ基因分型检测试剂盒，其中BD公 司产品采用了 SDA技术，市场占有率不高；而罗氏和QIAGEN公司产品采用了基于FRET探针 荧光PCR技术和熔解曲线分析方法，每个样品完成荧光PCR后还需要增加一个熔解曲线分 析步骤，根据扩增产物Tm值对HSV进行基因分型，操作步骤较多和所需检测时间较长。此 外，有文献(Anderson TP et al，J ClinMicrobiol, 2003,41 (5) :21；35_2137)报告采用熔解 曲线进行HSV基因分型存在熔解曲线特征不明显而导致结果无法判断的缺点。鉴于临床上对HSV感染疾病的病原体基因分型的需求和现有基因分型试剂盒的 技术局限性，有必要建立一种能快速检测HSV并进行基因分型的检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供一种单纯疱疹病毒基因分型检测方法与试剂盒，其特征在于，采用基 于HSV DNA聚合酶基因设计的引物探针，利用TaqMan探针多波长荧光PCR技术在单管中同 时检测HSV 1型和2型，以不同波长扩增模板的荧光信号和循环阈值判断样本中HSV的存 在和型别。试剂盒还使用了人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性。和国外HSV基因分型检测试剂盒比较，本专利技术的HSV基因分型检测试剂盒能在一个反应管中完成荧光 PCR反应后，无需增加熔解曲线分析步骤，因而操作简便，检测灵敏度高；同时试剂盒还可 避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，引入的内参照系统又能解决因样本中PCR抑制 剂引起的假阴性问题，可广泛应用于临床中该病原体的基因分型快速检测。1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成通过对GenBank中单纯疱疹病毒DNA聚合酶(Pol)基因序列查询，用分子生物 学专业软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其中一个区域序列(靶序列SEQ ID No. 1)对HSV-I和HSV-2两种基因型既有较好的序列同源性又有对两者相异的序列，按照 TaqMan荧光PCR设计的原则，基于SEQ ID No. 1靶序列设计了一对HSV特异性引物扩增SEQ ID No. 1片段上连续70 300个核苷酸，并用5’端标记不同波长荧光基团的两种特异性 TaqMan水解探针实时检测HSV-I和HSV-2。引物和探针碱基序列如下上游引物为5，-TCCATgCgCATCATCTACg-3，，如 SEQ ID No. 2 所示；下游引物为5，-TgTggCTCgCCATCTTgT-3，，如 SEQ ID No. 3 所示；HSV-I 荧光探针为 5，-ACTCCATATTTgTgCTgTgCCgC-3，(5，端标记 FAM(6-羧基荧 光素)，3，端标记 BHQ(Black Hole Quencher))，如 SEQ ID No. 4 所示。HSV-2 荧光探针 为 5，-TggCCACCAgCgCTTCgC-3，(5，端标记 HEX (6-羧基六氯荧光素)或 JOE (6-羧基-4，， 5，-二氯-2，，7，-二甲氧基荧光素)、VIC荧光基团，3，端标记BHQ)，如SEQ ID No. 5所示。HSV基因分型引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列；其 中引物序列也可以是按照靶序列SEQ ID No. 1向前或向后延伸10 20个核苷酸的序列。本专利技术的另一方面是采用了人工构建的内参照系统，用于监测样品扩增反应中可 能的PCR抑制物，避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针和内参DNA，其中内参探 针采用SEQ ID No. 6序列5，-TTCAgCgAgCgTgggACATCAgg-3，(5，端标记 Cy5 或 ROX (羧基 _X_ 罗丹明)、 TAMRA (6-羧基四甲基罗丹明)荧光基团，，3，端标记BHQ)，内参探针也可以是和上述序列同 源性大于85%以上的序列。内参照系统中的内参DNA为人工构建的DNA模板，它含有待检核酸(HSV DNA)扩 增引物中的一条引物序列和另一条引物互补序列、以及内参探针序列或其互补序列，并且 一条引物序列和另一条引物互补序列分别位于内参探针序列或互补序列的上下游。通过上述设计，获得的一对引物序列为两种单纯疱疹病毒基因型所特异，两条荧 光探针分别为HSV-I和HSV-2所特异；而内参照系统包括内参探针和内参DNA，上述引物探 针由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成后用无菌双蒸水溶 解至浓度为25 μ Μ, -20°C保存。2.试剂盒的制备含有上述引物和探针的单纯疱疹病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法) (32人份)，其组分如下(1)核酸提取液 1. 5ml，主要成分为 10 50mM NaOH, 5 IOmM EDTA、1% 10% Triton X_100、l% 10% NP-40。(2) PCR 缓冲液 0. 7ml，主要成分有 Tris-HCl (pH8. 3)、KC1、明胶、dATP、dGTP、dCTP、 dUTP、MgCl2、引物。 (3)荧光探针0. Iml，含有HSV-1、HSV-2荧光检测探针。 (4) Taq酶70 μ 1，含Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)。(5)内参照16 μ 1，含内参探针和内参DNA。(6)阴性对照200 μ 1，为Vero细胞培养物。(7)阳性对照200 μ 1，为HS本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术为一种单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）基因分型检测方法及试剂盒，其特征在于，采用基于ＨＳＶ　ＤＮＡ聚合酶基因（Ｐｏｌ）设计的引物探针，利用ＴａｑＭａｎ探针多波长荧光ＰＣＲ技术在单管中同时扩增检测单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）和２型（ＨＳＶ－２），对ＨＳＶ进行基因分型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31