新的甲壳类动物雄腺激素制造技术

本发明专利技术涉及一种新的甲壳类动物雄腺激素。更特定地，本发明专利技术涉及一种源自斑节对虾的雄腺激素。本发明专利技术还涉及所述激素在影响对虾及虾类养殖中的性别比例以及建立单性养殖中的应用。本发明专利技术还涉及激素及其基因或片段在性别决定中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的甲壳类动物雄腺激素本专利技术涉及一种新的甲壳类动物雄腺激素。更特定地，本专利技术涉及一种产自斑节对虾的雄腺激素。本专利技术进一步涉及所述激素在影响对虾和虾类培养以及建立单性养殖中 的应用。本专利技术还涉及所述激素及其基因或基因片段在性别决定中的应用。虾类和对虾的养殖及贸易在全世界范围内都是一项很重要的活动。所培育的主要 品种为斑节对虾(Penaeus monodon)(斑筛对虾，珍宝对虾，珍宝虎虾，黑虎对虾，蓝虎对虾，草虾......)，主要培育地在亚洲，2003年的水产养殖量为约600，000吨；还有南美白对虾(白腿虾，白虾)，主要培育产区在美洲、中国和泰国，年水产养殖量与斑节对虾相当。对于 上述品种，水产养殖远重要于捕获。对水产养殖量日益增长的需求意味着在发展更有效的培育系统方面亦有日益增 长的压力。由于多数虾类品种均为性二型的(Hansford and Hewitt，1994)，人们在建立单性 养殖上付出了很多努力。在那方面，若干小组曾尝试建立可靠的性别标记物(Khamnamtong 等，2006)。可选地，单性养殖可经由雄腺体外分泌雄性激素获得，如US6740794中公开的那 样。尽管这可能是一种感兴趣的方法，但由于所述雄腺激素或编码它的基因的结构是未知 的这一事实，该方法受到一定限制。近来Manor等(2007)描述了一种胰岛素样基因，其仅 在雄性澳大利亚螯虾Cherax quadricarinatus的雄腺中表达。它也许是一个感兴趣的候 选基因，可能编码雄腺激素，但其作用尚未阐明。更进一步地，至今尚未知其在对虾或虾类 中的同系物。由于数据库中仅能获得有限数量的对虾和虾类序列，且种间同源性即使存在 其概率可能也较低，因此搜寻同源序列受到一定阻碍。令人吃惊地，在一项黑虎虾(斑节对虾物种)的基于AFLP的转录谱实验中，我们 鉴定出两个雄腺特异的DNA片段，它们分别与等足类动物‘雄腺激素’和螯虾‘胰岛素样雄 腺’因子同源。经由进一步的cDNA测序和RACE实验，我们鉴定出四个mRNA，称为PmAGHl、 PmAGH2、PmAGH3、PmAGH4，最有可能通过选择性拼接而源自单一基因。更令人吃惊的是，对遗 传上雌性的幼虾施用重组Pm_AGHl，Pm_AGH2, Pm_AGH3和/或Pm_AGH4处理有雄性化的效 果。遗传上雄性幼虾可经由dsRNA介导的Pm_AGHl，Pm_AGH2，Pm_AGH3和/或Pm_AGH4的击 倒而被雌性化。本专利技术的第一方面是一种分离的蛋白质，其选自由SEQ ID N0 3、SEQ IDN0 6、 SEQ ID N0 9和SEQ ID N0 12，或其突变型或变体组成的组。优选地，所述蛋白质分离自 对虾属，更优选地分离自斑节对虾。这里描述的突变型和变体是指在BLASTp (Altschul等， 1997)中测定为具有，至少50%—致性的突变型和变体。优选地，所述突变型和变体以其激 素作用(雄性化作用；或当其作为显性阴性化合物起作用时的雌性化作用)来衡量的话，在 生物学上是具有活性的。更优选地，所述突变型和变体仍保留有具有SEQ ID N0 3,SEQ ID N0 6、SEQ ID N0 9或SEQ ID N0 12的分离蛋白质的雄性化能力。本专利技术的另一方面是一种核酸片段，其编码本专利技术所述的蛋白质。此处使用的核 酸片段可以是任意核苷酸，包括但不限于信使RNA、单链DNA、双链DNA，包括基因组DNA，可 能含有其内含子-外显子组织。所述核酸片段的最简形式限定为编码序列，但其可包括其他序列，诸如但不限于5’和3’的非翻译序列，调节序列诸如启动子和终止子序列以及内含子。优选地，所述核酸片段包含SEQ ID N0 2、SEQ ID N0 5、SEQ ID N0 8或SEQ ID N0 11(编码序列)。本专利技术的又一方面是一种核酸片段，包括SEQ ID N0 1、SEQ ID N0 4、SEQ ID N。7或SEQ ID N。10(mRNA)或SEQ ID N。13 (gDNA)，或其补体，或其功能片段。此处使 用的功能片段，其非限制性的实例有可用作检测引物的片段，或可用作反义RNA或RNAi来 下调表达的片段。本专利技术的另一方面是本专利技术所述蛋白质在调节对虾或虾类性别比例中的应用。优 选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选地所述对虾 或虾类是斑节对虾。本专利技术的又一方面是一种本专利技术所述的核酸片段在改变对虾或虾类性别比例中 的应用。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选 地所述对虾或虾类是斑节对虾。本专利技术的又一方面是一种本专利技术所述的核苷酸序列在决定对虾或虾类性别中的 应用。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选地 所述对虾或虾类是斑节对虾。实际上，基于所述序列，本领域技术人员可以显而易见地获 得能用于测定雄腺特异性基因的基因表达的引物。本专利技术的又一方面是一种建立对虾或虾类单性养殖的方法，包括使用本专利技术所述 蛋白质和/或核酸。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾 属，最优选地所述对虾或虾类是斑节对虾。实际上，通过将蛋白质注射入幼小的后幼虫动物 体内，雌性可被转化为雄性。相应地，反义RNA、dsRNA和/或RNAi的表达和/或注射将抑 制雄腺特异性蛋白质的表达并导致动物的雌性化。可选地，抗体，优选单链抗体或骆驼抗体 或拮抗本专利技术蛋白质的抗体片段，诸如纳米体，可用于将对虾或虾类雌性化。使用纯化的蛋 白质或其片段生产抗体的过程是本领域技术人员熟知的。本专利技术的又一方面是一种建立对虾或虾类单性养殖的方法，包括使用本专利技术所述 核酸决定性别。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属， 最优选地所述对虾或虾类是斑节对虾。相应地，本专利技术所述蛋白质也可用于决定性别，特别 是与上文中拮抗本专利技术蛋白质的抗体联合使用。作为一个非限制性的例子，此类抗体可用 于ELISA实验中检测动物中存在的雄腺特异性蛋白质的浓度。附图说明图1 编码雄腺激素的染色体DNA及其经由选择性拼接得到的信使RNA的示意图 概述。实施例实施例的材料及方法样品制备从成年雄虾第五步足基部剖取组织，其中雄腺应处于这个位置。对照组织剖取自 雌虾的相同位置。肌肉样品取自成年雄虾和雌虾的尾部。所有样品立即用液氮速冻并保存在-70°C下直至RNA制备。cDNA-AFLP经速冻的雄腺样品(η = 4)，周围组织的对照样品(η = 2)和肌肉样品(η = 6)在液氮条件下用研钵和研棒粉碎。完整的RNA用TRIzol试剂(invitrogen)分离。RNA的质 量采用光谱(Nanodrop)和凝胶电泳来评定。高质量RNA(2. 5 μ g)采用生物素化的寡_dT 引物转化为双链cDNA。在纯化ds cDNA(Qiaquick PCR纯化试剂盒，Qiagen)后，采用凝胶 电泳分析质量和产率。AFLP模板通过使用BstYI对ds cDNA进行限制酶切消化来制备。3，端片段使用 抗生蛋白链菌素包衣的磁珠(Dynal)分离并用Msel.进一步消化。限制位点特异性的适配 体连接到片段末端。适配体-连接混合物被稀释两倍至总本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的蛋白质，选自ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ°３，ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ°６，ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ°９和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ°１２，或其突变型或变体的组成的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F范布罗赛格姆，J斯塔埃郎，M维尔斯特克，
申请(专利权)人：弗拉芒区生物技术研究所，根特大学，比利时穆阿纳股份有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]