通过基因疗法治疗眼疾病的方法技术

本发明专利技术公开通过给有需要的受试者施用编码ＡＢＣＲ蛋白的腺相关病毒载体来治疗ＡＢＣＡ４基因突变相关疾病的方法；用于该方法的基因构建体和腺相关病毒载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供通过给有需要的受试者施用编码ABCR蛋白(“视网膜ATP结合盒转运 蛋白(ATP-binding cassette transporter-retinal)”)的腺相关病毒(adeno-associated viral)载体来治疗与ABCA4基因中的突变相关的疾病的方法。本专利技术还包括用于该方法的 基因构建体和腺相关病毒载体。
技术介绍
Stargardt 病(Deutman, A. F. a. H. C. B. 2001. Macular dystrophies. St Louis, Missouri, Usa : Schachat，A. P. 1210-1257 pp.) (STCD)是包括在黄斑变性类疾病中的常 染色体隐性遗传病，其在于双眼的中心凹中视锥细胞的进行性丧失，从而导致不同水平的 中心视力减退。在眼底镜检查时，常观察到在黄斑周围存在黄色雀斑，称为黄色斑眼底 (fundus flavimaculatus)病症。其通常在7至12岁之间发生，估计流行率为1/10，000个 体，这使得该疾病成为在生命的第一和第二个十年中影响感光细胞的遗传性黄斑变性的首 要原因，并且相应于所有视网膜营养不良(retinian dystrophy)的7%。该疾病最初被描 述为常染色体隐性遗传病，但存在一些显性模式的报道病例。隐性模式包括90%以上的病 例，是因染色体Iq21_pl3的缺陷导致的。显性模式似乎与第6号染色体上的变化相关，但 一些研究还报导了在第12号染色体上的定位。负责隐性Stargardt病的基因已被鉴定为ABCA4基因(Allikmets，R.，等人1997. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat Genet 15 :236_246),该基因编码 ABCR 蛋 白——ATP-结合盒(ABC)转运蛋白家族的成员。其在感光器中表达并且已被定位在外节盘缘。与ABCA4中的突变相关的其他疾病包括视锥视杆营养不良(cone-rod distrophy)(Maugeri, Α.,等 A, 2000, "Mutations in the ABCA4(ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy，，Am JHum Genet 67: 960-966.)和色素性视网膜炎(Cremers，F. P.,等人 I"8. "Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt' s disease gene ABCR" Hum Mol Genet 7 :355_362 ;Martinez_Mir,等人 1998. “Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR"Nat Genetl8 :11_12)。重要地，人中杂合 ABCA4 突变(Allikmets， R. ^A 1997"Mutation of the Stargardt disease gene (ABCR) in age-related macular degeneration，，Science 277 1805-1807)已经与年龄相关性黄斑变性(AMD)(老年人中 最常见的致盲疾病)相关(Seddon, J. M. 2001. Epidemiology of Age-Related Macular Degeneration. St Louis, Missouri, USA Schachat, A. P.1039_1050pp)。专利技术描述本专利技术基于如下发现具有AAV5壳体的编码ABCA4的腺相关病毒载体的施用(优 选眼内施用)导致该蛋白质定位在视杆外段和Abca4-/-视网膜的显著并且稳定的形态学和功能性改善。特别地，已发现在STCD动物模型中，rAAV2/5-CMV-Abca4的视网膜下给药 导致脂褐素(lipofuscin)水平、RPE异常和视网膜功能的显著矫正。这些发现为隐性Stargardt病(最常见的遗传性黄斑变性)以及与ABCA4突变相 关的其他疾病例如视锥视杆营养不良，色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性(AMD)(老 年人中最常见的致盲疾病)提供了有价值的治疗方法。因此，在第一方面，本专利技术涉及用于在受ABCA4基因突变相关疾病影响的哺乳动 物受试者中，特别是在人个体中，矫正视网膜异常和/或视网膜功能的方法，所述疾病优 选选自隐性Stargardt疾病、视锥视杆营养不良、色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性 (AMD)，本专利技术的方法包括步骤1)提供具有AAV5壳体的重组腺相关病毒(AAV)载体，所述载体具有包含编码功能 性ABCR蛋白的核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子有效地连接至指导其转录和翻译的 调控元件上；2)使用所述重组AAV载体转导感光细胞，从而在所述细胞中诱导ABCR蛋白的表达。具有AAV5壳体的载体经证明能够比其他血清型更有效地包装多达9kb，优选大约 4. 7至9kb的基因组，因此优选根据本专利技术使用它们递送ABCA4基因。尤其优选重组AAV2/5 载体，该载体优选被递送至视网膜下间隙，导致合适分子量和生物学活性的功能性ABCR蛋白产生。“功能性ABCR蛋白”是指，该ABCR蛋白展示天然蛋白质的功能，例如蛋白质在体内 充分结合ATP以为感光细胞提供功能。优选，功能性ABCR蛋白展示至少80%，更优选至少 90%，和最优选至少95%的天然蛋白质的功能。可以例如按照Sun等人，Nature Genetics 26,242-246(2000)(通过引用合并入本文)中描述的方法进行功能活性的测定。为了本专利技术的目的，将ABCA4的编码序列与能够在哺乳动物视网膜细胞，特别是 感光细胞中调控其表达的启动子序列功能性地连接，其中所述ABCA4编码序列优选选自 SEQ ID N0:1(人)和SEQ ID N0:6(鼠)或由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸序列 的序列。可根据本专利技术使用的合适的启动子包括CMV (SEQ ID NO: 2)、人RHO (SEQ ID NO: 3)、人ABCA4(SEQ ID NO 4)和CBA(SEQ ID NO 5)启动子、其保留转录启动子活性的片段和 变体。可按照对于本领域技术人员来说是已知的方法和使用本领域技术人员来说是已 知的技术进行AAV载体的构建。关于腺相关病毒载体的构建和治疗应用的理论和实践 已经在几篇科学和专利出版物中进行过举例说明(下列参考书目通过引用合并入本文 Flotte TR. Adeno—associated virus-based gene therapy for 本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有ＡＡＶ５壳体的重组腺相关病毒（ＡＡＶ）载体，所述载体载有包含编码功能性ＡＢＣＲ蛋白的核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子有效地连接至指导其转录和翻译的调节控制元件上，所述载体用于在罹患ＡＢＣＡ４基因突变相关疾病的受试者中治疗视网膜异常和／或视网膜功能障碍。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A奥里基奥，
申请(专利权)人：电视募捐基金会，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]