利用2’-取代寡核苷酸负调节基因表达制造技术

本发明专利技术公开了一种负调节动物的基因表达的方法，其中将一种包含与该基因互补的寡核苷酸的药物配制品口服给予动物。给予的寡核苷酸含有非磷酸二酯键的核苷酸间键合，且至少含有１个２′取代的核糖核苷酸，该寡核苷酸抑制基因产物的表达，因而负调节该基因的表达。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
利用2’-取代寡核苷酸负调节基因表达本专利技术背景本专利技术涉及基因表达调控。具体地说，本专利技术涉及利用合成的寡核苷酸来负调节动物的某个基因的表达。反义寡核苷酸疗法的发展前景是由发表于1977年和1978年的三篇文章首先提出的。Paterson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1977)74：4370-4374)发现无细胞的mRNA转译可通过mRNA与一种与之互补的寡核苷酸结合而得到抑制。Zamecnik等人(Pro.Natl.Acad.Sci.(USA)(1978)75：280-284 and 285-288)发现人工合成的与劳氏肉瘤病毒(RSV)基因组的一部分互补的13mer的寡核苷酸在被RSV感染的鸡成纤维细胞中，能抑制RSV的复制开可抑制RSV介导的从初级鸡成纤维细胞向恶性肉瘤细胞的转化。合成的寡核苷酸能用来抑制病毒繁殖和瘤形成，这一发现导致人们利用合成的寡核苷酸来抑制各种各样的病毒，例如HIV(见U.S.Patent No4,806,463)；流感病毒(见Leiter等人(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：3430-3434))；疱疹性口炎病毒(见Agris等人(1986)Biochem.25：6268-6275)；单纯疱疹病毒(见Gao等(1990)Antimicrob.Agents Chem.34：808-812)；SV40(见Birg等(1990)(Nucleic Acids Res.18：2901-2908)；及人乳头瘤病毒(见Storey等(1990)(Nucleic Acids Res.19：4109-4114)。Agrawal(Trends in Biotech.(1992)10：152-158)对利用合成的寡核苷酸及其类似物作为抗病毒制剂的方法作了详尽的综述。此外，合成的寡核苷酸还被用来抑制一系列非病毒性病原体及选择性地抑制特定细胞基因的表达。因此，利用合成的寡核苷酸作媒介来抑制病毒的繁殖，非病毒病原体的繁殖及基因的选择性表达的程序已经被完善地建立起来了。最近一段时间改进的寡核苷酸得到了很快的发展，它们在抑制病毒，病原体及选择性基因表达方面效率更高。其中有一些寡核苷酸对于核苷酸间的键合作了一些修饰，使得这些寡核苷酸的效率比未修饰前提高了。例如，Agrawal等(Proc.Natl.Acad.-->Sci.(USA)(1988)85：7079-7083)发现硫代磷酸寡核苷酸及某些寡核苷酸氨基磷酸酯在抑制HIV-l方面要比常规的磷酸二酯键连接的寡脱氧核苷酸的效率高得多。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1989)86：7790-7794)发现硫代磷酸寡核苷酸在抑制早期及慢性感染细胞中的HIV-1方面具有优势。此外还开发了一些在寡核苷酸内具有一种以上核苷酸间键的嵌合寡核苷酸。Pederson等(U.S.专利5,149,797和5,220,007)公开了一种嵌合寡核苷酸，其含有一个磷酸二酯键或硫代磷酸键连接的寡核苷酸核心序列，该序列旁侧为核苷酸甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。Furdon等(Nucleic Acids Res.(1989)17：9193-9204)披露了一种嵌合寡核苷酸，除具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的寡核苷酸区域外，还包括含有磷酸二酯键的寡核苷酸区域。Quartin等(Nucleic Acids Res.(1989)17：7523-7562)描述的嵌合寡核苷酸具有磷酸二酯键寡核苷酸区域和甲基膦酸化寡核苷酸区域。Inoue等(FEBS Lett.(1987)215：237-250)公开的嵌合寡核苷酸含脱氧核糖核苷酸及2’-O-甲基-核糖核苷酸区域。很多这类修饰的寡核苷酸有助于提高反义寡核苷酸疗法的效率。然而，在这些已知的寡核苷酸中仍存在着缺陷，这些缺陷限制了此类寡核苷酸作为治疗剂的效率。例如，Wickstrom(J.Biochem.Biophys.Meth.(1986)13；97-102)指出磷酸二酯键的寡核苷酸对核酸酶介导的降解作用敏感，因而其在体内的生物稳定性受到了限制。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：1401-1405)指出氨基磷酸酯化和甲基膦酸化的寡核苷酸在与RNA杂交时不能激活RNase H，而这种激活作用对反义寡核苷酸的功能可能是十分重要的。因此需要利用疗效提高的寡核苷酸来控制基因表达的方法。关于开发硫代磷酸键连接的寡核苷酸作为潜在的抗艾滋病制剂已有几篇报道发表。尽管对于寡核苷酸的化学及分子机制方面的广泛研究已经表明了这种新的治疗策略的潜在价值，但有关这些化合物在体内的约物代谢动力学及其代谢所知甚少。最近发表了一些关于这个主题的初步研究。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1991)88：7595-7599)描述了向小鼠静脉注射和腹腔注射硫代磷酸键连接的寡核苷酸20-聚体。在此实验中，最初的24小时后注射剂量的30％在尿中排出，同时在-->肝，肾中优先积累。血浆中的半衰期范围从1小时(t1/2α)到40小时(t1/2β)不等。随后的研究(Iversen(1991)Anti-Cancer Drug Design 6：531-538；Iverson(1994)Mol.Pharm.45：932-943也得到了类似的结果。然而，当寡核苷酸静脉注射和腹腔注射时其稳定性的问题依然存在。因此，仍然需要开发更加有效的治疗方法对基因表达进行负调控，这种方法应在操作上更简单以适于动物及待治疗的病症和靶基因。优选的方法应是简单，无痛，且精确地作用于靶基因。本专利技术的概述本专利技术提供了一种负调节动物的某个基因表达的方法，该方法涉及口服给予一种与此基因互补的寡核苷酸，因而避免了由于静脉注射及其他体内给药方式所可能导致的复杂情况。已发现特定的寡核苷酸(含非磷酸二酯键且最少含一个2’-取代核糖核苷酸)经动物口服摄入后在体内相对稳定，而且这些分子可从肠胃道很好地被吸收并分散至体内各个组织。利用此发现扩展得出了本专利技术，即对动物的某个基因的表达进行负调节的方法。本方法也是一种检测动物的各种基因的功能的手段，包括那些对动物的发育有重要作用的基因。目前，基因的功能只能通过繁琐的构建基因敲除动物如小鼠进行检测。这项工作复杂耗时且不适用于那些对动物发育至关重要的基因，因为基因敲除会产生致死的表型。本专利技术则克服了这种模式的缺点。在本专利技术的方法中，利用药物学可接受的载体使携带靶基因动物口服一种含有与靶基因互补的寡核苷酸的药物配制品。此寡核苷酸抑制基因的表达，因而对其表达进行负调节。就本专利技术的目的而言，术语“动物”包括人类及其他哺乳动物以及爬行类，两栖类和昆虫。术语“口服给予”指经过口腔消化摄取配制品或通过肠胃系统的其他部分-->包括食管摄入的过程。用于本文的术语“寡核苷酸”包括两个或更多的核苷酸或核苷酸类似物组成的聚合物，核苷酸由5’到3’的核苷酸间键连接在一起，这些键可以包括反义寡核苷酸
中任何已知的键。此类分子有一个3’末端和一个5’末端。给予的特定寡核苷酸最少含一个2’取代的核糖核苷酸，且通过非磷酸二酯键的核苷酸间键连接。就本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种负调节动物的某一基因的表达的方法，该方法包括口服给予一种药物配制品，该药物配制品包括存在于药物学可接受的载体中的与该基因互补的寡核苷酸，该寡核苷酸具有非磷酸二酯键的键合且含有至少一个２’－取代的核糖核苷酸，该寡核苷酸抑制该基 因产物的表达，从而对该基因的表达起负调节作用。

【技术特征摘要】
US 1994-10-25 08/328,5201、一种负调节动物的某一基因的表达的方法，该方法包括口服给予一种药物配制品，该药物配制品包括存在于药物学可接受的载体中的与该基因互补的寡核苷酸，该寡核苷酸具有非磷酸二酯键的键合且含有至少一个2’-取代的核糖核苷酸，该寡核苷酸抑制该基因产物的表达，从而对该基因的表达起负调节作用。2、如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸具有3’和5’末端，且2’-取代的核糖核苷酸位于3’末端。3、如权利要求2所述的方法，其中寡核苷酸进一步在5’末端含有至少一个2’-取代的核糖核苷酸。4、如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸的所有核糖核苷酸均为2’-取代的核糖核苷酸。5、如权利要求1所述的方法，其中2’-取代的核糖核苷酸为2’-O-烷基-核糖核苷酸。6、如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸含有至少一个脱氧核糖核苷酸。7、如权利要求6所述的方法，其中寡核苷酸含有一个能激活RNase H活性的至少四个连续脱氧核糖核苷酸的区域。8、如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸含有一个选自如下一组的核苷酸间键合：烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，氨基磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏迪尔阿格雷瓦尔，罗伯特B迪亚西奥，张瑞稳，
申请(专利权)人：海布里登公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]