等温检测方法及其应用技术

本公开涉及快速、单一温度（等温）检测特定核酸序列的方法和探针。所述方法和探针提供检测生物制剂（包括细菌和病毒）和检测任何核酸序列的特定基因标志的简便方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
该公开涉及核酸化学和分子遗传学领域。更具体而言，本专利技术涉及联合使用酶的 多元件(multi-element)多核苷酸探针在检测生物样品中的特定核酸序列中的应用。
技术介绍
存在多种这样的情况，其中期望检测复杂混合物背景中的低水平的特定核酸序 列。例子包括(但不限于)检测医学或环境病原体，或检测特定基因的等位基因以鉴定基 因异常。在所有情况下，旨在用于此目的的方法必须具有高特异性和高敏感性。优选的方 法还应该耐用的、在应用中相对简单的和廉价的。使用DNA或RNA检测，检测体系可能是必 需的，其足够敏感来检测单一分子(或至多一些分子)，原因在于一种靶序列可表示具有引 起广泛疾病潜力的单一传染剂。目前不存在这样的简便方法，其可直接检测特定序列的单一核酸分子，并且所有 目前使用的方法都包括一个或多个放大信号的步骤。由于DNA具有制备其本身拷贝的固有 能力，因此可以使用模拟细胞复制的体内过程的靶序列的体外复制，从而扩增复杂混合物 中靶多核苷酸的数量，使得它们可在具有需要的敏感度的情况下被识别。大多数DNA合成(除了短链DNA (例如寡核苷酸)的合成之外)通过酶法来进行， 其中使用DNA聚合酶。用于实现该目标的最常用的方法是聚合酶链式反应(PCR ；如美国专 利No. 4，683，195,4, 683，202和4，800，159中详细描述)。该方法通过使用热循环和耐热性 DNA聚合酶而提供靶分子的几何扩增。使用高温将两个互补DNA链变性(分开)，然后使用 低温促进通过引发和通过聚合酶的链合成。因此，PCR合成法使用这样的反应来进行，所述 反应包括三个步骤，每个步骤在不连续温度下发生。PCR产物的检测可通过下列方式实时监 控Taq DNA聚合酶(具有5’_3’核酸外切酶活性)介导的下游寡核苷酸的降解(Gelfand， 1993)，或者使用荧光嵌入染料，所述染料在结合至双链DNA时发出更大强度的荧光。允许 RNA靶的扩增和检测的PCR反应方案的改进是逆转录-PCR(RT-PCR)法，其是PCR和逆转录 反应的组合,这在 Trends in Biotechnology, 10 146-152 (1992)中有所描述。通常应用于分子诊断学领域的PCR方法的基础是其借助于扩增靶核酸而获得期 望的信号水平，进而检测这些扩增产物。相反，连接酶链式反应(LCR)通过探针本身构象的 几何级数增加而实现信号放大(Barany，1991)。在该方法中，DNA连接酶在存在靶互补链 的情况下结合两个寡核苷酸。所得连接的形式成为用于第二对引物的互补寡核苷酸。LCR 的一个示例性应用是在性传播疾病Chlamydia的检测中。其以试剂盒的形式出售(Roche Cobas，Roche Amplicor 板式试剂盒)。上述方法中的固有不足在于需要反应在高温和低温之间反复循环_例如，在PCR 的情况下在促进各轮模板变性和引物退火/延伸的温度的循环之间循环。因此，反应体系3使用不连续相或循环来进行，原因在于反应受到上述温度的限制。因此，所述方法花费更长 时间来进行，因为在各相要求的时间是不清楚的，并且还因为设备需要重复改变孵育温度。 在调节温度方面损失的时间和循环数成比例增加。另外，所述方法需要使用昂贵的可在时 间内精确地调节至较宽温度范围的热循环机。其是难以小型化的专门设备，并且需要不间 断的电源供应。因此，这些要求极大地妨碍了 PCR基分子诊断在使用点测试中的应用。针对这些限制，人们花费很多努力来开发等同于PCR的单一温度(等温)法。等温 法通常通过使用聚合酶而消除了部分热循环问题，所述聚合酶同时实现链置换和链合成， 进而除去高温变性步骤的需要。这种等温核酸扩增法的例子包括链置换扩增(SDA)法(如 JP-B 7-114718中所述)、和各种改进SDA法(如美国专利No. 5，824，517、以及PCT国际专利 申请公开WO 99/0921 UffO 95/25180和WO 99/49081中所述)。用于特定核酸扩增的其他等 温反应包括自主序列复制(3SR)法、核酸序列基扩增(NASBA)法(如日本专利No. 2650159 中所述)、转录介导的扩增(TMA)法、和Q. beta.复制酶法(如日本专利No. 2710159中所 述)。寡核苷酸的等温酶合成法在美国专利No. 5，916，777中有所描述。在这些方法的反应中，多核苷酸合成(通常包括从引物延伸的步骤、和/或引物退 火至单链延伸产物或初始靶序列、接下来从引物延伸的步骤)在于恒温下孵育的反应混合 物中平行发生，从而简化了应用并减少了反应时间。各种方法在它们如何解决引物入侵的 困难和常规PCR要求的退火方面存在较大的区别。在等温核酸扩增法中，SDA法是这样的 体系的例子，其中靶DNA最后被扩增。在SDA的初始描述中，样品中的靶核酸序列(及其互 补链)通过使用DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的双链置换而扩增。所述方法要求四种引 物扩增，其中两种应该被设计成含有限制性核酸内切酶的识别位点。所述方法要求使用大 量改性脱氧核糖核苷酸三磷酸酯作为大量DNA合成中的底物。这些方法中使用的改性脱氧 核糖核苷酸三磷酸酯的例子是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸酯，其中α-位的磷酸酯基团 的氧原子被硫原子(S)取代。(α-S)脱氧核糖核苷酸引入含有限制性核酸内切酶的识别位 点的引物新合成的互补链中会产生在核酸内切酶的裂解点处的半硫代磷酸酯。因此，限制性核酸内切酶只攻击未改性的链，从而促进攻击位点的序列5’的延伸 和攻击位点的3’侧链的置换。然而，如果反应常规进行的话(例如基因测试)，和使用改 性脱氧核糖核苷酸三磷酸酯有关的费用变得较高。此外，改性核苷酸(例如(α-S)脱氧核 糖核苷酸)引入扩增的DNA片段中可停止使用限制性核酸内切酶对扩增的DNA片段的裂解 性，例如在经历限制性核酸内切酶片段长度多态性(RFLP)分析时就是这样。改进SDA法(如美国专利No. 5，824，517中所述)是DNA扩增法，该方法使用嵌合 引物，所述嵌合引物包含RNA和DNA，并且具有基本元件结构(其中DNA位于至少3’ -末 端)。美国专利No. 7，056, 671和美国专利申请公开No. 2003/0073081涉及嵌合DNA/RNA 寡核苷酸引物在SDA反应方案中的另一种应用。改进SDA法(如PCT国际专利申请公开 WO 99/09211中所述)需要使用产生3，突出端的限制酶。改进SDA法(如PCT国际专利 申请公开WO 95/25180中所述)要求使用至少两对引物。改进SDA法(如PCT国际专利申 请公开WO 99/49081中所述)要求使用至少两对引物和至少一种改性脱氧核糖核苷酸三磷 酸酯。改进SDA法(如美国专利申请公开No. 2005/0136417中所述)使用尿嘧啶DNA转葡 糖基酶和脱嘌呤核酸内切酶来攻击双链DNA部分的一个链的作用，所述链在存在dUTP的条 件下合成。这在已经引入尿嘧啶的位置处有效地产生随即引发位点。在该方案下，dUTP与4dTTP的比例的调节可用于调整攻击事件的频率。这些方法可被认为在操作上类似于PCR， 只要通过靶扩增实现靶核酸的敏感性检测即可。SDA的涉及DNA靶的等温扩增的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中的靶核酸的方法，该方法包括下列步骤：ａ）提供包含单链靶核酸的样品，其中所述单链靶核酸具有游离的３’末端；ｂ）提供单体多核苷酸探针，包含：ｉ）至少两个靶结合域，其中所述结合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影响的域分开，或ｉｉ）靶结合域和至少一部分所述靶核酸的拷贝，其中所述靶结合域和所述靶核酸被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影响的域分开；ｃ）使所述样品和所述单体多核苷酸探针的多于一种拷贝接触；ｄ）使所述样品和合成所述单体探针的反向互补的聚合酶接触；ｅ）使所述样品和至少一种核酸酶接触以裂解所述核酸酶裂解元件或降解所述易受核酸酶降解影响的域；以及ｆ）检测所述探针的裂解或降解。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-1-8 61/019,809一种检测样品中的靶核酸的方法，该方法包括下列步骤a)提供包含单链靶核酸的样品，其中所述单链靶核酸具有游离的3’末端；b)提供单体多核苷酸探针，包含i)至少两个靶结合域，其中所述结合域被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影响的域分开，或ii)靶结合域和至少一部分所述靶核酸的拷贝，其中所述靶结合域和所述靶核酸被核酸酶裂解元件或易受核酸酶降解影响的域分开；c)使所述样品和所述单体多核苷酸探针的多于一种拷贝接触；d)使所述样品和合成所述单体探针的反向互补的聚合酶接触；e)使所述样品和至少一种核酸酶接触以裂解所述核酸酶裂解元件或降解所述易受核酸酶降解影响的...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJ索罗，LS佩恩，
申请(专利权)人：赛进有限公司，
类型：发明
国别省市：NZ[新西兰]