通过包括热循环的多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法技术

本发明专利技术涉及扩增靶核酸序列的方法，该方法包括多重置换扩增和热循环。根据该方法，可有效地扩增靶核酸序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的示例性实施方式涉及通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法，更具体而言，涉及包括热循环的通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法。
技术介绍
已知各种扩增核酸的方法。这些方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应 (LCR)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、使用QP复 制酶的扩增和多重置换扩增(MDA)。 MDA是基于通过多元引物进行的靶核酸序列的链置换扩增。在MDA中，产生复制链 并且在复制期间，至少一条复制链通过另一复制链的链置换复制而从靶核酸序列上置换下 来。对于MDA而言，可利用的引物可包括与靶序列的一条链互补的引物组以及与靶序列的 另一条链互补的引物组。而且，所述引物可为一组具有随机序列的引物。此外，所述引物可 为这样的一组引物，该组中每一引物仅与靶序列的一条链杂交。 相关技术公开了一种扩增靶核酸序列的方法，其中该方法包括使一组引物、DNA聚 合酶以及靶样品接触，并且在促进该靶序列的复制的条件下温育该靶样品。该靶样品未经 历变性条件，并且该靶序列的复制产生复制链，其中在复制期间，所述复制链中的至少一条 通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。 MDA在基本上恒温的温度下进行，并且温育在足以促进引物与靶序列的杂交的低 温下进行。也就是说，为了促进引物的杂交，在低于聚合酶活性最适温度的温度下进行温 育。结果，只有在初始的变性和退火阶段结合、并且在相应位置处结合的引物发生扩增，因 而可发生扩增偏差，由此降低扩增效率。
技术实现思路
本专利技术的示例性实施方式包括通过多重置换扩增(MDA)，包括热循环，来扩增耙核 酸序列的方法。 其它各方面有些在随后的说明中进行阐述，有些可从该说明中明晰，或者可通过 所介绍的实施方式的实践而获知。 本专利技术的示例性实施方式可包括扩增靶核酸序列的方法，其中该方法包括使一 组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和温育该溶液以复制该靶核酸序列，其 中该靶核酸序列的复制产生复制链并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复 制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来，其中进行所述温育时，在DNA聚合酶活性最 适温度范围与促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围之间进行热循环。附图说明 图1的电泳图像显示在3(TC或6(TC扩增靶序列时、或者在约3(TC与约6(TC之间 进行热循环时的扩增结果。 图2显示靶序列按照图1所示在约3(TC与约6(TC之间进行热循环时的扩增结果 和使用对照产物获得的结果。具体实施例方式现在将详细提及示例性实施方式，其实施例说明于附图中，其中相同的附图标记始终表示相同的要素。在这方面，当前的各实施方式可具有不同的形式并且不应解释为限 于本文中所进行的说明。因此，仅在下面通过参照附图描述这些实施方式以解释本说明的 各方面。 根据本专利技术实施方式的扩增靶核酸序列的方法包括使一组引物、DNA聚合酶和靶 核酸在溶液中接触。 引物可具有约5至约20bp的长度。解链温度Tm可根据所使用的引物的长度和核 苷酸组成以及反应溶液中的组分(例如阳离子的浓度)而不同。本文中所用术语解链温 度Tm是指核酸分子的多份拷贝中一半核酸链处于双链状态而另一半处于无规巻曲状态 时的温度。例如，当引物具有约5至约20bp的长度并且引物的核苷酸是天然核苷酸时，Tm 可为约1(TC至约8(TC。引物可具有约5至约8bp的长度。引物可具有约6bp的长度。除 了天然核苷酸之外，引物还可包括修饰的核苷酸。例如，引物可包括至少一个修饰的核苷酸 并且因此是耐核酸酶的，例如是耐外切核酸酶的。修饰的核苷酸可为生物素化核苷酸、荧光 标记的核苷酸、5_甲基-dCTP、 BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)_2'-脱氧尿苷-5'-三磷 酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且，引物可用可检测的标记物进行标记。引物组可包 括多个引物。引物组可包括与靶核酸的同一条链互补的两个或更多个引物，例如，三个或更 多个引物、或者四个或更多个引物、或者五个或更多个引物。引物组还可包括至少一个与靶 核酸的另一条链互补的引物。引物组可包括多个引物并且各引物可包括互补部分，其中这 些引物的这些互补部分各自与靶核酸的不同部分互补。引物组可包括具有随机核苷酸序列 的引物。在本专利技术的实施方式中，引物可以是长度为5bp、6bp、7bp或8bp的随机弓I物、或其 混合物。 DNA聚合酶活性最适温度可高于引物与靶序列杂交时的温度。详言之，DNA聚合酶 的最适温度可高于与靶序列杂交的引物变性时的变性温度。在这种情况下，变性温度可 为约50%或更多的双链变性时的温度、约60%或更多的双链变性时的温度、约70%或更多 的双链变性时的温度、约80%或更多的双链变性时的温度、或者约90 %或更多的双链变性 时的温度。也就是说，当引物链和耙序列的双链的一部分例如约10%、约20%、约30%、约 40% 、或者约50%或更多未变性而保留时，可通过新引物的退火而改进扩增。 根据本专利技术的实施方式，术语最适温度可根据条件如反应溶液而不同，但在给 定的缓冲液条件下所用聚合酶的最适温度对于本领域技术人员是显而易见的。本文中所用 术语最适温度范围可为最适温度士1(TC、或最适温度士5t:、或最适温度±2. 5t:，并且 低于在促进引物与靶序列杂交的温度范围内因温育而复制的链变性时的变性温度。术语 变性温度与以上描述的相同。 根据本专利技术的实施方式，除非另外进行说明，术语杂交温度是指通过引物与靶 序列之间的杂交而使一半的可杂交位点发生杂交时的温度。杂交温度可以由本领域技术人 员通过实验或计算很容易地得出。可通过使用公开于SantaLucia. &Hicks (2004) An皿.Rev.Biophys. Biomol. Struct. ，33 :415-40中的方法计算杂交温度。 根据本专利技术的实施方式，促进引物与靶序列杂交的温度范围可以是促进了引物与靶序列之间的杂交的温度范围。为此，所述温度范围可等于或低于DNA聚合酶的最适温度-5°C 、 DNA聚合酶的最适温度-10°C 、或DNA聚合酶的最适温度_15°C 。 根据本专利技术的实施方式，DNA聚合酶的最适温度范围可为约3(TC至约75t:，而促进引物与靶序列杂交的温度范围可为约0t:至约3(rC。根据本专利技术的实施方式，DNA聚合酶的最适活化温度范围可为约3(TC至约75t:，而促进引物与靶序列杂交的温度范围可为约0t:至约30°C 。 DNA聚合酶的最适温度范围例如(p29 DNA聚合酶的最适温度范围可为约32°C ，外切(_) BstDNA聚合酶的最适温度范围可为约65°C ， VENT 外切DNA聚合酶的最适温 度范围可为约75，9° Nm DNA聚合酶的最适温度范围可为约75t:，Klenow片段的最适温 度范围可为约37°C，匪LV逆转录酶的最适温度范围可为约42°C。 DNA聚合酶为能进行链置换复制的聚合酶，其可为(p29 DNA聚合酶、Tts DNA聚合 酶、M2DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、PRD1 DNA聚合酶、或Bst DNA聚合 酶，但不限于此。 表1. DNA聚合酶及其特性 <本文档来自技高网...

【技术保护点】
扩增靶核酸序列的方法，该方法包括：　　使一组引物、ＤＮＡ聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和　　温育该溶液以复制该靶核酸序列，其中该靶核酸序列的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来，　　其中所述温育时在两个温度范围之间进行热循环，　　其中一个温度范围是该ＤＮＡ聚合酶的活性最适温度范围，另一个温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围。

【技术特征摘要】
KR 2008-8-8 78141/08扩增靶核酸序列的方法，该方法包括使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触；和温育该溶液以复制该靶核酸序列，其中该靶核酸序列的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来，其中所述温育时在两个温度范围之间进行热循环，其中一个温度范围是该DNA聚合酶的活性最适温度范围，另一个温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围。2. 权利要求1的方法，其中所述引物包括随机核苷酸序列或特定序列。3. 权利要求1的方法，其中所述引物具有约5至约20bp的长度。4. 权利要求1的方法，其中所述引物具有约5至约8bp的长度。5. 权利要求1的方法，其中所述引物具有约6bp的长度。6. 权利要求l的方法，其中该DNA聚合酶的最适温度高于杂交至该靶序列上的引物发 生变性时的变性温度，并且低于在促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围内进行温育期 间复制链发生变性时的变性温度。7. 权利要求1的方法，其中该DNA聚合酶的最适温度范围为约4(TC至约65°C。8. 权利要求l的方法，其中促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约ot:至约35°C。9. 权利要求l的方法，其中该DNA聚合酶包括(p29 DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA 聚合酶、VENT1 DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRDlDNA聚合酶、或Bst DNA聚合酶。10. 权利要求l的方法，其中该DNA聚合酶包括外切(-)Bst DNA聚合酶，该DNA聚合酶 的最适温度范围为约46t:至约75t:，并且促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约 4t:至约35°C。11. 权利要求10的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李周远，
申请(专利权)人：三星电子株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]