乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针及其应用方法技术

本发明专利技术属医学领域，涉及乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针及其应用方法。本发明专利技术的乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针，是ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１１、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ　１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１６、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ　１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１８或者ＳＥＱＩＤ　ＮＯ　１９中的一种或者几种。将本发明专利技术的检测探针与液相芯片技术结合，可以快速、准确确定样本的乙肝病毒拉米夫定耐药性，特异性高、灵敏度好、检测通量大，大大节约了确定耐药变异株种类所需的成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医学领域，涉及乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针及慢性乙肝患 者使用阿德福韦抗病毒治疗后耐药情况的临床监测。
技术介绍
阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)是开环嘌呤类核苷酸类似物，不仅对慢性 乙型肝炎患者有较好的疗效，对阿德福韦耐药的HBV也有较好的抑制作用，已被广泛应用 于慢性乙型肝炎患者(包括阿德福韦耐药患者)的治疗。尽管HBV对阿德福韦耐药的发生 率低于拉米夫定，但长期服用仍有较高的耐药率，对于初治的患者，ADV治疗5年的耐药率 分别为0，2% 3 %，5. 9% 11 %，18%，28 % ；对于LAM治疗失败后换用ADV单药治疗的 患者，ADV的耐药率更高，1 2年的耐药率分别为6. 4% 17. 5%和25. 4%。目前已证实 ADV耐药相关的变异主要包括有两种rtA181V/T/S和rtN236T。对于阿德福韦耐药变异的 检测，除了 DNA测序分析之外，国外报道可使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP)、INNO-LiPA探针检测法、PCR及固相杂交等方法。测序分析方法需要昂贵的测 序仪，检测过程耗时较长，且只有当病毒群中HBV变异株至少占30%以上时(通常需50% 以上)，才能检测到变异株，用于变异株检测有较大的局限性；基于PCR的方法可能一次只 能检测一种类型的变异；而RFLP方法只能判断有无变异，具体的点突变的情况无法检测； INNO-LiPA探针检测法虽然灵敏度较高，但检测成本较高，且操作复杂耗时，检测通量较低， 同时价格昂贵，应用受到限制，难以在我国推广应用。为了适应我国的国情，满足医疗、科 研的需要，急需建立快速、简便的、高度敏感性和特异性的高通量检测阿德福韦变异株的方 法。对于LAM耐药相关性变异的检测，除了 DNA测序分析之外，国外报道可使用聚合 酶链反应_限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、INNO-LiPA探针检测法、特异性PCR 及固相芯片等方法。测序分析方法需要昂贵的测序仪，检测过程耗时较长，且只有当病毒 群中HBV变异株至少占30%以上时(通常需50%以上)，才能检测到变异株，用于变异株 的早期检测有较大的局限性；基于PCR-RFLP的方法可能一次只能检测一种类型的变异；而 INNO-LiPA探针检测法虽然灵敏度较高，但检测成本较高，且操作复杂耗时，检测通量较低， 同时价格昂贵，推广应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针及相应的乙 肝病毒阿德福韦相关变异应用检测方法。本专利技术提供了一种乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针，该检测探针可以是 SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID N010.SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ IDNO 15、SEQID NO 16、SEQID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种。较好的，该探针由SEQ ID NO 6、SEQID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 或者 SEQ ID NO 13 中的一种或者几种，以及 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQID NO 17,SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19 中的 一种或者几种组成。将序列如SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7,SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10、 SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或者SEQ ID NO 13中的一种寡聚核苷酸分子与序列如SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19 所示的一种寡聚核苷酸分子组合，进行检测可同时获得两个耐药性位点的测试结果，能够 更准确地获得样本的阿德福韦耐药性特征。本专利技术的探针也可由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19全部14种寡核苷酸分子组成。 同时使用14种寡核苷酸分子作为检测探针，不仅能准确地获得样本的阿德福韦耐药性特 征，而且可以确定乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的类型。上述这些探针可以根据其核苷酸编码序列，采用化学合成方法，也可以采用从乙 肝病毒阿德福韦耐药变异株的基因组DNA通过多次PCR获得。本专利技术还提供了将该检测探针用于确定乙肝病毒阿德福韦耐药变异株方面的应用。本专利技术的检测探针可用于制备检测乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的芯片。实际应用中，可以将本专利技术的乙肝病毒阿德福韦耐药变异株检测探针与液相芯片 技术结合。液相芯片技术(MASA)是美国纳斯达克上市公司Luminex研制出的新一代生物芯 片技术平台，它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持，又能提供高通量的新 一代分子诊断技术平台。其技术原理是用聚苯乙烯制成的大小均一的圆形小球(微球)， 直径在IOnm IOOOum之间，按照不同的比例掺入两种不同的红色分类荧光，将微球进行染 色，使每个微球都有了一个特定的光谱地址。将不同的探针分别以共价方式结合到不同的 具有特定颜色的微球上，然后和待测样品进行液相杂交，再将微球成单列通过Luminex平 台的检测通道，用两束不同颜色的激光进行扫描，一束激光检测特定光谱地址的微球，确定 探针的种类；另一束激光检测微球上探针信号的强弱，以确定靶基因的含量。所得到的数据 经电脑处理后可以直接用来判断样本中是否含有某种特定的变异位点及靶基因相对含量。 利用上述系统可同时完成上百种变异的检测，并可以同时检测96个样本；从标本采集、DNA 抽提到检测完毕，仅需5-7小时即可完成。和固相芯片方法相比，它具有以下优点1.重复 性好；2.敏感性高；3.灵敏度好；4.特异性高因为只读微粒上的信号；5.检测迅速液相 悬浮杂交比固相扩散杂交快；6.价格低设备和试剂的价格都低于芯片；7.检测结果易分 析。本专利技术中确定乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的方法包括如下步骤(1)将探针与微球结合；(2)扩增样本核酸序列中阿德福韦耐药位点；(3)将(1)所得的产物与(2)的产物杂交，根据杂交反应结果判断样本的阿德福韦 耐药性。上述步骤(1)中，较好的是探针中每一种特定寡聚核苷酸与特定微球结合。杂交 后，通过检测微球的种类就能够确定寡聚核苷酸的种类。所述的微球也可以由类似大小的颗粒状物质代替。颗粒状物质的直径可以采用 10-1000 μ m。如果需要采用两种及两种以上的微球置于同一反应液中，可以将微球偶联本文档来自技高网...

【技术保护点】
乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针，其特征在于，所述的检测探针是ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　９、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ　１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１８或者ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１９中的一种或者几种。

【技术特征摘要】
乙肝病毒阿德福韦耐药变异株的检测探针，其特征在于，所述的检测探针是SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO19中的一种或者几种。2.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，该探针由SEQID NO 6、SEQ ID NO 7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID N01USEQ ID NO 12或者SEQ ID NO 13 中的一种或者几种，以及 SEQ ID N014、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继明，刘红艳，李义良，毛日成，尹永喜，夏佳慧，范丽丽，李新艳，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]