本发明专利技术公开了一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的ＲＴ－ＬＡＭＰ引物，所述ＲＴ－ＬＡＭＰ引物由一对外围引物和一对内引物组成，其中，这一对外围引物的序列为ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１所示，一对内引物的序列分别为ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：３和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：４所示。以本发明专利技术所设计的引物采用ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法对各种基因型ＣＳＦＶ野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒检测结果均为阴性。应用本发明专利技术引物序列采用ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法，可以非常准确地区分ＣＳＦＶ野毒株和ＣＳＦＶ疫苗株，具有特异性强、灵敏性高、重复性好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一套检测毒株的引物，尤其涉及一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株 的RT-LAMP引物，属于猪瘟病毒毒株的检测领域。
技术介绍
猪瘟(classical swine fever， CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的一种以高热 和出血为主要特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重大传染病之一，被世界动物卫 生组织(0IE)列入须申报OIE疾病名录。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属，其基因组为线状单 股正链RNA，长约12. 3kb，含有单一的开放阅读框架(ORF)，编码一个由3898个氨基酸残基 组成的多聚蛋白，经蛋白酶裂解为4种结构蛋白(衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、El、E2)以 及8种非结构蛋白(NPM、 p7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B)，其中NS5B基因序列是可 靠的CSFV基因型分类依据。 与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)也可以感 染猪，与CSFV存在血清学交叉反应，给猪瘟诊断带来很大困难(孙世琪，靳野，郭慧琛， 等.我国近期猪瘟分子流行病学动态.动物医学进展，2004，25(6) :69-71 ;Paton DJ， Greiser-Wiike I. Classical swine fever__an update. Res VetSci，2003，75(3): 169-178.)。另外，由于猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我国的大规模应用，使得CSFV野毒感 染猪和疫苗接种猪的鉴别变得困难。目前猪瘟诊断方法有很多，包括病毒分离培养、动物接 种试验、血清学诊断方法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等。其中病毒分离和动物试验不 同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又都存在一定的 血清学交叉反应，难以将CSFV与同属的BVDV和BDV感染区分开，也很难鉴别CSFV野毒感 染和疫苗接种，而实时荧光定量PCR方法对实验仪器的要求很高。虽然单克隆抗体技术用 于诊断在一定程度上弥补了这一缺陷，但是基于抗原抗体反应的检测技术仍有一定的局限 性(如敏感性不够高)，如胶体金检测技术。上述方法或多或少存在缺陷，不适合于基层实 验室及现地的快速准确检测。 环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification， LAMP)方法是日本 学者Notomi等在2000年专利技术的一项恒温核酸扩增新技术。该技术特异性强、灵敏度高、成 本低廉，特别适合在现场和基层部门应用。由于反应产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，因此 肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。目前，日本已利用这种特性研制出专门用于 LAMP检测的实时监控浊度仪，可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。此外还可以向产 物中加入荧光染料的方法进行判定。自从LAMP方法问世以来，已经应用于胚胎性别鉴定和 不同病原体的检测。 文献报道表明，LAMP方法已经成功用于人、畜禽和水生动物的多种病原体的检测。 如犬瘟热病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒等都已应用该技术建立了相应的检测方法。关于 CSFV的RT-LAMP方法也有报道(陈蕾，范学政，王琴，等.猪瘟病毒RT-LAMP快速诊断方法的 建立.动物传染病与兽医公共卫生，2008， 209-213 ;Chen HT， Zhang J，Ma LN， et al. R即idpre_clinical detection of classical swinefever by reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification[J]. Mol Cell Probes,2009，23(2) :71-74.)，但均不能用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一套可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 —套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，由一对外围引物和一对内引物组成;其中，一对外围引物的序列分别为SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:l所示，一对内引物的序列分别为SEQID NO :3和SEQ ID NO :4所示。 本专利技术根据GenBank中35株CSFV全基因序列及16株BVDV全基因组序列，设计针对CSFV NS5B区域的RT-LAMP引物(因为NS5B基因序列存在的差异是CSFV基因型分类依据，所以根据NS5B区域的碱基差异设计了专门针对CSFV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一对外围引物F3/B3(SEQ ID NO:l禾PSEQ ID NO : 1)， 一对内引物FIP/BIP (SEQ IDN0 :3和SEQ ID N0:4所示)，以样品的cDNA为模板，利用Bst DNA聚合酶，在62。C恒温条件下进行扩增，扩增产物中加入SYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果。该方法可检测出不同基因型的CSFV野毒株，其检出极限为2. 5TCID5。的CSFV，与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当；特异性试验表明，该方法对猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应；通过对126份不同样品进行比对检测，该方法与实时荧光定量RT-PCR方法的符合率达100% ，与引物-探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%。该方法无需特殊仪器，是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法。 以本专利技术所设计的引物采用RT-LAMP检测方法对各种基因型CSFV野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、BVDV-1株以及其它常见猪源病毒检测结果均为阴性，并且通过对大量的临床样品进行检测，其结果与本试验室已经建立的CSFV实时荧光定量RT-PCR方法的检出结果完全符合，而与PriPro-ET PCR方法的符合率为98. 4X，经查证PriPro-ET PCR方法的敏感性为20拷贝，而CSFV实时荧光定量RT-PCR敏感性为41. 8拷贝(Zhao JJ， Cheng D， Li N， et al. Evaluation of a multiplex real-timeRT-PCR for quantitative anddifferential detection of wild-type viruses andC-strain vaccine ofClassical swine fever virus.Vet Microbiol，2008，126(1-3):1-10.)(相当于3. 2TCID5。， Cheng D， Zhao JJ， Li N， et al. Simultaneous detectionofClassical swine fever virus and North American genotype Porciner印roductiveand respiratory syndrome virus using a duplex real—time RT—PCR. J Virol本文档来自技高网...
【技术保护点】
一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的ＲＴ－ＬＡＭＰ引物，其特征在于：所述ＲＴ－ＬＡＭＰ引物由一对外围引物和一对内引物组成；其中，所述外围引物的序列分别为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１所示，所述内引物的序列分别为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示。
【技术特征摘要】
一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，其特征在于所述RT-LAMP引物由一对外围引物和一对内引物组成；其中，所述外围...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，张兴娟，孙元，刘大飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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