本发明专利技术公开了马传染性贫血病毒（Ｅｑｕｉｎｅ？Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ？ＡｎｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）致病强毒株ＥＩＡＶＤＬＶ３４的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞适应株及其应用。本发明专利技术选择ＦＤＤ细胞作为感染介质，将ＥＩＡＶＤＬＶ３４毒株在ＦＤＤ细胞进行６次传代，获得的毒株命名为ＥＩＡＶ－ＤＬＶ３４－Ｆ６，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ？Ｎｏ．３２３１。本发明专利技术所建立的毒株可以在体外培养的ＦＤＤ细胞上进行良好复制，并保持其致病性和基因特点，该毒株的建立为ＥＩＡＶ及慢病毒毒力和免疫原性相关研究提供了重要的研究材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus, EIAV)强毒 株，尤其涉及马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株及其构建方法，本专利技术 还涉及该马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株在构建具致病力感染性克 隆中的应用，属于马传染性贫血病毒领域。
技术介绍
马传贫弱毒疫苗是将野外分离的高致病力毒株(EIAVW)经体外驴单核细胞120余 代的人工致弱过程而获得的。强毒株(EIAVW)通过细胞传代，经历着毒力逐渐减弱，免疫原 性逐渐增强的过程。 马传贫弱毒疫苗作为唯一成功应用的慢病毒疫苗，为慢病毒免疫保护机理提供了 重要的模型。中国特有的强毒株和弱毒疫苗株的评价体系更有助于阐明其免疫保护机制。 但是，由于马传贫强毒株特有的培养特性(原代单核细胞和全血清培养)，限制了其生物学 特性的研究。因此，在保持致病力的前提下，改变强毒株培养方式，对其生物学特性和免疫 保护的研究，以及马传贫疫苗的改进和新型疫苗构建均有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的之一在保持马传染性贫血病毒致病强毒株的致病力的前提下，改变其 培养方式，得到一株马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，该驴胎皮肤细 胞适应株可以在体外培养的驴胎皮肤细胞FDD上进行良好复制，并保持其致病性和基因特 点； 本专利技术目的之二是将上述的马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应 株应用于构建感染性克隆，为马传贫病毒及慢病毒毒力和免疫原性相关研究提供重要的研 究材料； 本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的 —株马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，其微生物保藏号是 CGMCC No. 3231 ;分类命名马传贫病毒；保藏时间是2009年8月13日；保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院 微生物研究所。 马传贫弱毒疫苗是将野外分离的高致病力毒株(EIAVW)经体外驴单核细胞120余 代的人工致弱过程而获得的。强毒株(EIAVW)通过细胞传代，经历着毒力逐渐减弱，免疫原 性逐渐增强的过程。因此，本专利技术根据我国强、弱毒株的致弱及产生特点，选择了传代过程 EIAV^m毒株。马体试验显示该毒株仍具有较高的致病力，可引起马急性死亡(图1)。考虑 到病毒的大量培养及免疫检测的可操作性，本专利技术选择FDD细胞作为感染介质，将EIAVm34 毒株在FDD细胞进行6次传代，获得的毒株命名为EIAV-DLV34-F6。 免疫荧光及RT酶活性检测显示，单核细胞嗜性的强毒株(EIAVDW34)逐渐获得了在3驴皮肤细胞中复制的适应性，病毒对FDD细胞的感染能力随着传代的增加而增强。经6次 传代后，已经获得4X 107PFU/ml的感染滴度(图2)。为了探究细胞嗜性的改变对病毒毒力 的影响，本专利技术将EIAV-DLV34-F6复归马体进行毒力测定，实验结果显示，马体分别在接种 后10天、24天出现马传贫典型临床症状，急性发病的诱发时间与强毒株(EIAVW)较为一致， 说明该毒株仍保持与亲本强毒株相似的致病力。可见，细胞嗜性的改变并未对病毒毒力产 生影响。 此外，感染性克隆是进行病毒基因功能研究的重要手段。以此毒株为骨架构建感 染性克隆是本专利技术的重要应用。利用该方法获得的致病力毒株的感染性克隆保持完整的强 毒株基因背景。SEQ ID N0:1是EIAV-DLV34-F6全基因序列，序列比对表明该毒株与亲本 强毒株的同源性平均为96. 1 % (表2)，在马传贫病毒准株多样性范围内，本专利技术建立的强 毒株EIAV-DLV34-F6为构建具致病力感染性克隆，奠定了基础。 以上结果证实本专利技术已成功构建了可以在体外培养的驴胎皮肤细胞FDD上进行良好复制，并保持其致病性和基因特点的马传贫强毒株，该毒株的建立为马传贫病毒及慢 病毒毒力和免疫原性相关研究提供了重要的研究材料。附图说明 图1DLV34毒株马体毒力测定试验结果 图2免疫荧光检测毒株DLV34转接驴皮肤细胞后不同代次的感染水平 图3EIAV-DLV34-F6病毒滴度图4EIAV-DLV34-F6马体毒力测定试验结果 图5感染性克隆构建示意图 图6感染性克隆构建前期工作结果图具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实验例1EIAV-DLV34-F6毒株的筛选及鉴定 本试验选择了传代过程EIAVDW34毒株(EIAVDW34为EIAVW通过驴单核细胞体外连 续传代获得)。马体试验显示该毒株仍具有较高的致病力，可引起马急性死亡(图l)。本 专利技术选择FDD细胞作为感染介质，将EIAVDW34毒株在FDD细胞进行6次传代，获得的毒株命 名为EIAV-DLV34-F6。 免疫荧光及逆转录酶(RT)活性检测显示(参见图2，表1)，单核细胞嗜性的强毒 株(EIAVm34)逐渐获得了在驴皮肤细胞生长活性，病毒感染能力随着传代的增加而增强。经 6次传代后，已经获得1. 8X 107PFU/ml的感染滴度(图3)。为了探究细胞嗜性的改变对病 毒毒力的影响，本专利技术将EIAV-DLV34-F6复归马体进行毒力测定。图4结果显示，马体分别 在接种后10天、24天出现马传贫典型临床症状，急性发病的诱发时间与强毒株(EIAVW)较 为一致，说明该毒株仍保持与亲本强毒株相似的致病力。可见，细胞嗜性的改变并未对病毒毒力产生影响。 表1 单位DLV34-F1阳性对照阴性对照0D405/492nm1. 9713. 4570. 131 具体实验方法如下将所检毒株500 i！ 1接入培养成单层的驴胎皮肤细胞(FDD)细 胞。37t:温箱培养8天后抽取接毒细胞培养上清200ia。同时，设立相应的阴性对照(未 接毒细胞培养上清)和阳性对照(EIAVDLV毒株细胞培养液)。加入100ii1 PEG8000溶液， 充分混匀后4。C过夜。次日，按照Reverse Transcriptase AssayColorimetric Kit说明书 测定接毒细胞培养上清中逆转录酶活性。判定标准OD ^阴性对照+2SD即为阳性，说明所 检毒株具有逆转录酶活性可以表达完整的病毒粒子。 利用该方法获得的致病力毒株的感染性克隆保持完整的强毒株基因背景。SEQ ID NO :1显示EIAV-DLV34-F6全基因序列，通过基因组中变异率较高的几个基因与亲本强毒株 的序列比对表明，该毒株与亲本强毒株的同源性平均为96. 1%，其主要几个变异率较高基 因的同源性见表2，基因变异程度在马传贫病毒准株多样性范围内。 表2肌v毒抹同EIAVW的同源性(IOgp90gp45 S2 LTRE跳一—_ 一E亂96,197,65 97,0 97.55EIAV曙94, 3亂8 93.9 94,895. 2197. 42 95,1 96, 6 试验例2EIAV-DLV34-F6毒株的应用例 以EIAV-DLV34-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株马传染性贫血病毒（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，其特征在于，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３１。
【技术特征摘要】
一株马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus)致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，其特征在于，其微生物保藏号是CGMCC No.3231。2. 按照权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：林跃智，周建华，李利，曹学智，姜成刚，王雪峰，马建，吕晓玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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