本发明专利技术属医学领域，涉及乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及其应用方法。本发明专利技术的乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针，是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １６、ＳＥＱＩＤＮＯ １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １８或者ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １９中的一种或者几种。将本发明专利技术的检测探针与液相芯片技术结合，可以快速、准确确定样本的乙肝病毒拉米夫定耐药性，特异性高、灵敏度好、检测通量大，大大节约了确定耐药变异株种类所需的成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属医学领域，涉及乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及慢性乙肝患 者使用拉米夫定抗病毒治疗后耐药情况的临床监测。
技术介绍
以拉米夫定(lamivudine，LAM)为代表的核苷类似物类抗乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus,HBV)药物的临床应用是慢性乙型肝炎治疗史上的里程碑。迄今为止， 已经有100多万慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治疗，使慢性乙型肝炎的治疗取得了巨 大的进步。抗HBV药物的广泛应用在为慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B,CHB)带 来福音的同时，也带来了严重的耐药问题。例如拉米夫定治疗1 4年的耐药率可分别高 达14%、38%、49%和66%。引起HBV对拉米夫定耐药主要原因是在HBV的聚合酶基因的 逆转录B区的180位氨基酸由亮氨酸(L)替换成了蛋氨酸(M)和C区的204位氨基酸由蛋 氨酸M替换成了缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)。即造成YIDD或YVDD变异，LAM与其的结合 力就会下降，导致HBV对LAM产生耐药性。除了 YMDD变异之外，在LAM选择压力下，还会在 YMDD基序之外出现补偿性变异。目前，国内尚无同时用于多个变异位点检测的试剂盒。为 此，我们研发了液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术，可 快速、简便和高通量地检测LAM耐药变异株。对于LAM耐药相关性变异的检测，除了 DNA测序分析之外，国外报道可使用聚合 酶链反应_限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、INNO-LiPA探针检测法、特异性PCR 及固相芯片等方法。测序分析方法需要昂贵的测序仪，检测过程耗时较长，且只有当病毒 群中HBV变异株至少占30%以上时(通常需50 %以上)，才能检测到变异株，用于变异株 的早期检测有较大的局限性；基于PCR-RFLP的方法可能一次只能检测一种类型的变异；而 INNO-LiPA探针检测法虽然灵敏度较高，但检测成本较高，且操作复杂耗时，检测通量较低， 同时价格昂贵，推广应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针及相应的乙 肝病毒拉米夫定相关变异应用检测方法。本专利技术提供了一种乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针，该检测探针可以是 SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID N016、SEQ ID NO 17、 SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种。较好的，该探针由SEQ ID NO 12、SEQID NO 13、SEQ ID NO 14中的一种或者几种 和 SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19 中的一种 或者几种组成。将序列SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14中的一种寡聚核苷酸 分子与序列如 SEQID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 或者 SEQ ID NO 19中的一种寡聚核苷酸分子组合，进行检测可同时获得两个耐药性位点的测试结果，能够更准确地获得样本的拉米夫定耐药性特征。本专利技术的探针也可由SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ IDNO 15、 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 全部八种寡核苷酸分子组 成。同时使用八种寡核苷酸分子作为检测探针，不仅能准确地获得样本的拉米夫定耐药性 特征，而且可以确定乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的类型。上述这些探针可以根据其核苷酸编码序列，采用化学合成方法，也可以采用从乙 肝病毒拉米夫定耐药变异株的基因组DNA通过多次PCR获得。本专利技术还提供了将该检测探针用于确定乙肝病毒拉米夫定耐药变异株方面的应用。实际应用中，可以将本专利技术的乙肝病毒拉米夫定耐药变异株检测探针与液相芯片 技术结合。液相芯片技术(MASA)是美国纳斯达克上市公司Luminex研制出的新一代生物芯 片技术平台，它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持，又能提供高通量的新 一代分子诊断技术平台。其技术原理是用聚苯乙烯制成的大小均一的圆形小球(微球)， 直径在IOnm IOOOum之间，按照不同的比例掺入两种不同的红色分类荧光，将微球进行染 色，使每个微球都有了一个特定的光谱地址。将不同的探针分别以共价方式结合到不同的 具有特定颜色的微球上，然后和待测样品进行液相杂交，再将微球成单列通过Luminex平 台的检测通道，用两束不同颜色的激光进行扫描，一束激光检测特定光谱地址的微球，确定 探针的种类；另一束激光检测微球上探针信号的强弱，以确定靶基因的含量。所得到的数据 经电脑处理后可以直接用来判断样本中是否含有某种特定的变异位点及靶基因相对含量。 利用上述系统可同时完成上百种变异的检测，并可以同时检测96个样本；从标本采集、DNA 抽提到检测完毕，仅需5-7小时即可完成。和固相芯片方法相比，它具有以下优点1.重复 性好；2.敏感性高；3.灵敏度好；4.特异性高因为只读微粒上的信号；5.检测迅速液相 悬浮杂交比固相扩散杂交快；6.价格低设备和试剂的价格都低于芯片；7.检测结果易分 析。本专利技术中确定乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的方法包括如下步骤(1)将探针与微球结合；(2)扩增样本核酸序列中拉米夫定耐药位点；(3)将(1)所得的产物与(2)的产物杂交，根据杂交反应结果判断样本的拉米夫定 耐药性。上述步骤(1)中，较好的是探针中每一种特定寡聚核苷酸与特定微球结合。杂交 后，通过检测微球的种类就能够确定寡聚核苷酸的种类。所述的微球也可以由类似大小的颗粒状物质代替。颗粒状物质的直径可以采用 10-1000 μ m。如果需要采用两种及两种以上的微球置于同一反应液中，可以将微球偶联欧 联不同的显色剂或者荧光物质进行区分，通过检测微球在一定条件下的显色或者所发射的 荧光就可以确定微球的种类。通常采用有机材料制作微球，例如本专利技术实施例中的聚苯乙 烯。也可以采用其它带有羧基功能基团的材料制作微球，以便偶联探针。也可以修饰探针， 以便其能与微球较好偶联。步骤(2)中，采用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。进行PCR反应在拉米夫定耐药 位点相应的核苷酸编码序列的上游和下游设计引物，从而扩增样本中拉米夫定耐药位点相RTSlRTASlRTS2RTAS2应序列。所用的弓I物可以按照常规方法设计，例如采用下表的引物。引物序列 名称序列(5’ 一3’ ) 5’ -CTAGGACCCCTGCTCGTGTT-3’ (SEQ ID NO 20) 5， -GCAAACCCCAAAAGACCCA-3， (SEQID NO 21) 5’ -ATTCCTATGGGAGTGGGCCT-3(SEQ ID NO 22) 5’ -Biotin-CCCAAAAGACCCACAATTCG-3(SEQ ID NO 23)步骤(3)中，根据杂交后微球所结合探针的种类和数本文档来自技高网...
【技术保护点】
乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针，其特征在于，所述的检测探针是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５、ＳＥＱ ＩＤＮＯ １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８或者ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １９中的一种或者几种。
【技术特征摘要】
乙肝病毒拉米夫定耐药变异株的检测探针，其特征在于，所述的检测探针是SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ IDNO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种。2.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，该探针由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14 中的一种或者几种和 SEQ ID NO 15,SEQ ID N016、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18或者SEQ ID NO 19中的一种或者几种组成。3.如权利要求1所述的检测探针，其特征在于，该探针由SEQID NO 12,SEQ ID NO 13、 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：张继明，刘红艳，李义良，毛日成，尹永喜，夏佳慧，范丽丽，李新艳，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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