评估细胞和细胞培养物的方法技术

公开了用于评估细胞培养物组成（例如用以区分软骨细胞与成纤维细胞）的方法和用于评估细胞个体的表型（例如评估为软骨细胞）的方法。该方法可以用于例如评估用于治疗软骨缺陷的软骨细胞培养物。在一些实施方案中，本发明专利技术牵涉根据成纤维细胞标志物的表达水平来鉴定细胞培养物组成或细胞身份。在其它实施方案中，本发明专利技术牵涉在细胞培养物样品中或细胞个体中比较至少一种软骨细胞标志物和至少一种成纤维细胞标志物的表达水平。在例示性的实施方案中，所述软骨细胞标志物是乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白１（ＨＡＰＬＮ１），而所述成纤维细胞标志物是微原纤维相关蛋白５（ＭＦＡＰ５）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定细胞培养物组成的方法，更具体地，涉及区分软骨细胞 与成纤维细胞的方法。
技术介绍
关节软骨损伤具有较差的修复速率，这部分由于软骨组织中缺乏血液供 给(Basad等，于Hendrich等,Cartilage Surgery and Future Perspectives, Thieme Verlag， 49-56 (2003))。膝关节创伤能导致例如软骨和骨软骨损伤，而且此类 损伤可发展成骨关节炎(Brittberg等，New England Journal of Medicine, 331 (14): 889-895 (1994))。在骨关节炎的严重病例中，可能需要全膝置换。然而， 膝置换中所使用的人工假肢具有有限的寿命，如此膝置换不是最佳的治疗 法，特别是对于非老年患者(Brittberg等，见上文)。在 一 些情况中，关节软骨损伤可以通过自体软骨细胞植入来修复 (Brittberg等，Clin. Orthopaed. Rel. Res 367S: S147-S155 (1999))。在这种规程 中，从患者收获软骨细胞，在细胞培养中扩充以增加软骨细胞的数目，然后 回植入该患者的损伤部位中。用 一片骨膜组织覆盖软骨细胞以将软骨细胞密 封入损伤部位中。虽然所培养的软骨细胞在培养中具有去分化的趋势，但是 在成功的植入物中，去分化的软骨细胞保持其再分化潜力，而且会在植入后 再分化成产生透明软骨组织的软骨细胞。在一种称为基质诱导的自体软骨细胞植入的改良技术(MACI⑧植入规 程)中，将培养的软骨细胞加载至胶原基质上，然后将它们植入患者中(Basad 等，见上文)。另外，胶原基质可以用血纤蛋白胶而非通过缝合来固定，使其 成为更简单的手术技术。可使用不同的技术和培养基来培养软骨细胞。供软骨细胞培养用的无血 清培养基的例子及用于分离和增殖软骨细胞的方法记载于例如美国专利号6，150,163和7,169,610,及美国临时专利申请号60/805,307，本文通过提及而 将它们收录。成纤维细胞或成纤维细胞样细胞(诸如滑膜细胞)可以与软骨细胞共分 离，如此在制备软骨细胞植入物的过程中在细胞培养物中共增殖。已知软骨 细胞在它们在培养中去分化时呈现成纤维细胞的外观(Benya和Shaffer, Cell, 30:215-224(1982))。不过，它们维持其分化潜力，即它们能够在植入后再表 达软骨细胞表型。因此，根据外观区分所培养的去分化软骨细胞与共培养的 成纤维细胞或成纤维细胞样细胞会是困难的。胞的基因表达样式。例如，天然软骨软骨细胞中高度表达的许多标志物在所 培养的软骨细胞中以降低的水平表达(Binette等，J. Orthopaed. Res., 16: 207-216 (1998))。因而，这样的软骨细胞标志物的表达可能未必能区分去分 化的软骨细胞与可在细胞培养物中存在的其它类型的细胞。此外，许多已知 的成纤维细胞标志物在去分化软骨细胞和天然软骨软骨细胞两者中均表达， 尽管处于不同水平。因而，这样的成纤维细胞标志物的表达水平可能未必能 指明样品中所存在的细胞是去分化软骨细胞、成纤维细胞、还是成纤维细胞 样细胞。需要鉴定软骨细胞、成纤维细胞和成纤维细胞样细胞的方法，特别是适 用于细胞培养的方法。专利技术概述在某些方面，本专利技术的方法提供了评估细胞培养物组成(例如用以区分 软骨细胞与成纤维细胞)的方法和用于评估细胞个体的表型(例如评估为软 骨细胞)的方法。本专利技术的方法可用于例如评估用于治疗软骨缺陷的软骨细 胞培养物。在一些实施方案中，本专利技术牵涉根据成纤维细胞标志物的表达水 平来鉴定细胞培养物组成或细胞身份。在其它实施方案中，本专利技术牵涉比较 至少一种软骨细胞标志物和至少一种成纤维细胞标志物在细胞培养物样品 中或在细胞个体中的表达水平。在例示性的实施方案中，所述软骨细胞标志 物是乙酰透明质酸和蛋白聚冲唐连4妄蛋白1 (hyaluronan and proteoglycan link7protein 1， HAPLN1),而所述成纤维细胞标志物是樣i原纤维相关蛋白5 (microfibrillar associated protein 5, MFAP5)。本专利技术至少部分基于MFAP5作为细胞表型标志物的鉴定，其在某些非软 骨细胞细胞类型(诸如成纤维细胞和滑膜细胞)中高度表达，而在软骨细胞 中以显著更低的水平表达。本专利技术进一步至少部分基于如下发现，即MFAP5 和软骨细胞标志物(诸如HAPLN1)的表达水平比率是自软骨活组织检查物 衍生的培养物中细胞表型的可靠指示物。虽然在一些条件下可能优选使用这 两种类型的标志物(即成纤维细胞和软骨细胞标志物)以便证实细胞培养物 的组成或细胞个体的表型，但是本专利技术还提供了如下实施方案，其中仅测定 MFAP5标志物的标准化表达水平便可足以实现该目的。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物不同于MFAP5，而是这样的， 即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞中低。在一些实施方案 中，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞(例 如原代和/或传代软骨细胞)中比在成纤维细胞和/或滑膜细胞中低。在一些 实施方案中，所述成纤维细胞标志物在软骨细胞中比在成纤维细胞和/或滑膜 细胞中表达得低至少2倍、5倍、8倍、10倍、或更小。如此，在一个方面，本专利技术提供了一种评估细胞培养物(例如试验性地 含有软骨细胞的细胞培养物)组成的方法(方法l);和一种评估细胞个体表 型的方法(方法2)。在方法l的实施方案中，各种标志物的表达水平以该标 志物在多个细胞(例如培养物样品)中的平均表达水平测定。在方法l的实 施方案中，细胞培养物的组成可以作为整体进行评估以确定其是否含有软骨 细胞。在方法2的实施方案中，标志物的表达水平以该标志物在所评估的细 胞个体中的表达水平测定。如此，方法l鉴定细胞培养物的组成，而方法2鉴 定细胞个体的表型，例如该细胞是否是软骨细胞。在一些实施方案中，方法l包括a) 从细胞培养物荻得多个细胞；b) 测定本专利技术的成纤维细胞标志物在来自所述细胞培养物的多个细胞中 的平均表达水平；并c) 根据所述表达水平来确定所述培养物的组成；其中低于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物含有软骨细胞。或者，高 于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物不含软骨细胞(例如所述培养物8不包含至少50%、 55%、 60%、 65%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%、 99%或更多的软骨细胞)。在一些实施方案中，方法l牵涉将成纤维细胞标志物(MFAP5或另一种 成纤维细胞标志物)和软骨细胞标志物(例如HAPLN1)的表达水平与对照 进行比较或者彼此进行比较。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物和 所述软骨细胞标志物是这样的，即它们在原代和/或传代软骨细胞中的表达水 平比率(软骨细胞标志物比成纤维细胞标志物)等于或大于在培养的成纤维 细胞中的表达比率的5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍或更多倍。具体地，在一些实施方案中，方法l包括a) 从细胞培养物获得多个细胞；b) 测定软骨细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；c) 测定成纤维细胞标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括：　ａ）从所述细胞培养物获得多个细胞；　ｂ）测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞或滑膜细胞中低； 并　ｃ）根据所述成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成，　其中：１）所述细胞培养物包含软骨细胞或者２）所述成纤维细胞标志物是微原纤维相关蛋白５（ＭＦＡＰ５）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-4-6 60/910,5741.一种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从所述细胞培养物获得多个细胞；b)测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞或滑膜细胞中低；并c)根据所述成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成，其中1)所述细胞培养物包含软骨细胞或者2)所述成纤维细胞标志物是微原纤维相关蛋白5(MFAP5)。2. —种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a) 从所述细胞培养物荻得多个细胞；b) 测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞或滑膜细胞中低；并组成，其中低于预定阈值的平均表达水平指明所述细胞培养物包含软骨细胞。3. —种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a) 从所述细胞培养物获得多个细胞；b) 测定MFAP5在所述多个细胞中的平均表达水平；并其中低于预定阈值的MFAP5平均表达水平指明所述细胞培养物包含软骨细胞。4. 权利要求l的方法，其中1)所述细胞培养物包含软骨细胞及2)所述成纤维细胞标志物是MFAP5。5. 权利要求l的方法，其中所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化6. 权利要求1的方法，进一步包括测定软骨细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；并在步骤c)中，根据所述软骨细胞标志物的平均表达水平和所述软骨细胞和成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成。7. 权利要求6的方法，其中所述成纤维细胞标志物和所述软骨细胞标志物是这样的，即它们在软骨细胞中的表达水平比率(软骨细胞标志物比成纤维细胞标志物)等于或大于在真皮成纤维细胞或滑膜细胞中的比率的5倍。8. 权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物选自表l中所列出的软骨细胞标志物。9. 权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLN1。10. 权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLNl,而所述成纤维细胞标志物是MFAP5 。11. 权利要求6的方法，其中所述成纤维细胞标志物和软骨细胞标志物的表达水平是在RNA水平测定的。12. 权利要求ll的方法，其中所述表达水平是使用PCR测定的。13. 权利要求12的方法，其中所述表达水平是使用比较GrPCR方法测定的。14. 权利要求6的方法，其中使用比较Gr PCR方法测定得出的大于0.25的所述软骨细胞标志物与所述成纤维细胞标志物的表达水平比率指明所述细胞培养物含有软骨细胞。15. 权利要求14的方法，其中所述比率指明所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬M拉普科，斯蒂芬J杜瓜伊，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]