LSPR的酶测定制造技术

本发明专利技术提供了检测局域表面等离子体共振（ＬＳＰＲ）检测系统表面的折射率变化的方法。该方法包括利用固定的酶从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在ＬＳＰＲ支持表面积聚。所述方法也包括利用ＬＳＰＲ检测由不溶性产物的存在引起的表面反射光或透射光的变化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】LSPR的酶测定相关申请的交叉引用本申请要求2007年1月3日提交的第60/878,617号美国临时申请的 权益，将该临时申请整体并入本文。
技术介绍
基于用于信号放大的酶反应的比色测定由于其便于使用及具有足 够的灵敏度已经广泛应用于临床诊断学领域。酶标记的更新率、所用 的酶底物和酶量决定灵敏度。碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶是两种最 常见的酶标记。前者经常用于与氯化硝基蓝四氮唑(NBT)和/或5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯对曱苯胺盐(BCIP)联用。后者经常与3,3',5,5'-四曱 基联苯胺(TMB)、 4-氯-l-萘酚(4-CN)、 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB) 等联用。在酶底物与所述酶反应时，形成不溶性有色产物。可以用肉 眼观察不溶物以获得定性结果，或利用筒单的光学检测器获得半定量 结果。因此，多少不溶性产物积聚以及光密度随着积聚发生多大变化 决定了检测极限。已经付诸了许多努力来增加酶作用的效率和开发具有光密反应产 物的底物。通过升高温度来促进酶促反应没有太多余地，因为较高的 温度导致酶的降解。增加酶的量的确有用，但对多少抗体可以结合到 固体表面有限制。用于免疫层析试剂盒的多孔膜已经达到了这种限制， 没有显著的改变可以期待。与比色方法相关的另 一缺点是差的动力学 范围。只要检测方法依赖于吸光度的测量，对于低于2的光密度的精确 测量是可能的，且另一方面最小吸光度是0.1级别。因此，范围只有20， 仅覆盖了一个数量级多点。尽管肯定会做出改进，但没有 一 个适用于大范围酶/底物结合的通 用方法。本专利技术令人惊讶地提供了不依赖于对特定酶或底物的改进的 通用方法。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术提供了检测局域表面等离子体共振(LSPR)检测系统表面的折射率变化的方法。该方法包括利用固定的酶 从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在LSPR支持表面积光或透射光的变化。在另一个实施方案中，本专利技术提供了具有第一固体支持物的LSPR 传感器、置于第一固体支持物上的LSPR支持表面、靠近LSPR支持表 面的固定的酶以及酶底物。附图简要说明观'J定(colorimetric 2-step sandwich assay)的比寿交。 图2显示了使用本专利技术方法的l-步测定。图3显示了实施酶促反应后，金纳米颗粒的扫描电子显微镜(SEM) 照片(1)以及表示在IL-6测定末，酶促反应过程中光密度变化的图。图4显示了可将抗体与纳米颗粒(l)、与第 一 固体支持物(2)以及第 二固体支持物(3,4)结合的多种方式。专利技术详述 I.总述本专利技术提供了通过利用局域表面等离子体共振(LSPR)支持表面检 测分析物的方法。LSPR支持表面包括金包被表面，在该表面上有诸如 珠的金包被的纳米颗粒阵列。本专利技术的方法利用夹心测定检测分析物。 本专利技术的方法通过用固定在LSPR支持表面的珠的金表面上的第 一捕 获部分捕获分析物检测所述分析物。然后利用具有检测部分的第二捕 获部分检测所述分析物的存在。在优选的实施方案中，所述夹心测定是免疫测定，其中捕获部分 是抗体，而分析物是抗原。在另一个优选的实施方案中，检测部分是酶，以使当第二捕获部分结合到分析物时，将可溶性酶底物加入混合物中，以致该酶将所述酶底物转化为在LSPR支持表面积聚的不溶性产 物。不溶性产物在LSPR支持表面的积聚导致肉眼可见的反射或透射光 的波长位移(wavelength shift)。 LSPR的特性是需要4及少的不溶性产物 来诱发肉眼可见的波长位移。与本专利技术的方法相比，现有方法直接利 用比色法检测不溶性产物的存在，因此需要大量的不溶性产物沉积。色酶免疫测定的灵敏度。这通过局域表面等离子体共振效应放大了检 测，通过在低容积反应区搅动样品缩短了测定时间并将动力学范围扩 大到几个数量级之外。可以通过利用与LSPR支持表面相关的近场光学(near-field optics) 提高比色酶免疫测定的灵敏度。在常规测定中，从酶促反应形成的有 色产物可以通过肉眼检测，或通过监测在特定波长的吸光度的简单装 置检测。如果在LSPR支持表面进行比色酶免疫测定，可以通过检测反 射光或透射光的波长位移来间接检测浓度低得多的有色产物的产生。 在固体表面吸收的纳米颗粒形成了 LSPR支持表面，所述表面的特征在 于4兌消光i普(sharp extinction spectrum)。该4兌消光"i普可以是电,兹光i普的 任一部分，诸如在可见区中。锐消光谱是由于局域表面等离子体现象， 即局域自由电子的集体共振引起的。消光谱显示了对局部折射率非常 敏感的依赖性。通过经由不溶性产物的吸收谱监测不溶性产物在LSPR 支持表面积聚诱发的折射率变化，检测较低浓度的抗原是可能的。常规比色法依赖于积聚的酶促反应产物的直接光学检测，具有仅 稍高于1个数量级的动力学范围。这已受到大多数光学系统高精确地测 量0.1至1.5范围内的光密度的能力限制。本专利技术的方法可以在不同的波 长监测LSPR支持表面的消光谱的变化。尽管常规的比色测定已经尝试 了相似的方法，但常规方法使用有色产物的直接监测，而不是如本发 明所实践的间接监测。此外，可以通过操纵物理参数来调整LSPR支持 表面的灵敏度。因此，可以将动力学范围扩展几个数量级。II.定义7如本文所使用的，术语"LSPR支持表面"指能通过受限自由电子的 共振荡形成光学近场的表面，所述受限自由电子的共振荡，通常称为 局域表面等离子体共振。LSPR支持表面的特征在于如下文更详细描述 的纳米颗粒。LSPR支持表面可以是不透明的或透明的，且可以透射或 反射光，或即透射光也反射光。如本文所使用的，术语"纳米颗粒"指直径为约10力至约10—7米的颗 粒和珠。纳米颗粒可以由任何合适的物质制成，且包括但不限于珠、棱锥、金属丝、网丝等。本领域技术人员会认识到，其它的纳米颗粒 可以用于本专利技术中。如本文使用的，术语"过渡金属"指周期表的元素，包括Sc、 Ti、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Y、 Zr、 Nb、 Mo、 Tc、 Ru、 Rh、 Pd、 Ag、 Cd、 La、 Hf、 Ta、 W、 Re、 Os、 Ir、 Pt、 Au和Ac。本4贞i或 技术人员会认识到，上述的过渡金属的每一种都可以采用几种不同的 氧化状态，所有的状态都用于本专利技术。在一些实例中，形成了最稳定 的氧化状态，但其它的氧化状态也用于本专利技术。如本文使用的，术语"固体支持物"指其上可以添加或形成LSPR支 持表面的任何物质。合适的固体支持物的实例包括，但不限于，玻璃(包 括孔径可调的玻璃聚合物(例如，聚苯乙烯、聚氨基曱酸酯、聚苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物)、硅橡胶、石英、乳胶、过渡金属、磁性材料、 二氧化硅、氮化硅、砷化镓以及其衍生物。除了表面的反应位点，固 体支持材料通常抵抗它们接触的各种化学反应条件。用于本专利技术的固 体支持物可以是平滑的或粗糙的。平滑表面是在表面上具有导致粗糙 的最少特征的表面。粗糙表面是在表面上具有产生磨擦力的大多数特 征的表面。本专利技术的固体支持物包括第一固体支持物和第二固体支持 物。固体支持物可以是平面的或非平面的、柔性的或刚性的。另外， 固体支持物可以是多孔的网或织品。固体本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测局域表面等离子体共振（ＬＳＰＲ）检测系统表面的折射率变化的方法，所述方法包括：　ａ）使用固定的酶从酶底物产生不溶性产物，其中所述不溶性产物在ＬＳＰＲ支持表面积聚，以及　ｂ）利用ＬＳＰＲ检测由所述不溶性产物的存在引起的表面的反 射光或透射光的变化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：达尼埃勒格利翁，兰迪斯道尔，竹井弘之，
申请(专利权)人：莱姆达仁公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]