来自紫菜属的硝酸还原酶，组成及其使用方法技术

本文描述的ＮＲ酶发现于红藻Ｐｏｒｐｈｙｒａ?ｐｅｒｆｏｒａｔａ（ＰｐＮＲ）和条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａ?ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ（ＰｙＮＲ））。本发明专利技术提供了涉及改变植物中的ＮＲ活性，氮利用和／或摄取的方法和组成。本发明专利技术涉及用于在低氮肥力的条件下具有保持的或增加的产量的植物生产方法。本发明专利技术提供了分离的硝酸还原酶（ＮＲ）核酸和它们编码的蛋白质。本发明专利技术进一步提供了重组表达盒、宿主细胞、和转基因植物。用编码ＮＲ酶的核苷酸序列转化的植物显示了改善的特性，例如增加的产量和生长。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自紫菜属的硝酸还原酶，组成及其使用方法
技术介绍
许多植物的驯化与产量的极大提高相关。负责驯化的植物中产量的极大差异的特定基因的鉴定已经成为农业研究的重要焦点。影响产量的基因的一个群是硝酸还原酶基因。这些基因用于提高作物植物，尤其是玉蜀黍中的氮的利用。所述基因可以用于改变植物的遗传组成，使得它们以目前的施肥标准可以更多产，或者以显著减少的肥料输入维持它们的生产率。提高的氮应用效率可以起因于氮肥的增强的摄取和同化和/或积聚的氮储备的后来的再流通和再利用。因此包含这些基因的植物可以用于提高产量。在氮肥的获得受限的发展中国家中和在氮利用的水平维持较高的发达国家中，提高玉米中的氮利用效率将提高每个单位的输入氮肥的玉米可收获的产量。氮利用的提高还允许降低农场上的输入成本(on-farm input costs)、降低对氮肥生产所需的不可再 生能源的利用和依赖、以及降低氮肥制造和农业应用对环境的影响。近来已经付出了很多努力来通过植物中硝酸还原酶(NR)的过表达改善作物植物的氮效率。有一组研究人员已经应用了白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)&拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)NR cDNA或基因在不同启动子例如35S CaMV(白花丹叶烟草)控制之下的表达。Ferrario, et al., (1995) “Effects of constitutiveexpressionof nitrate reductase in transgenic Nicotiana plumbaginifoliaL.1nresponse to varying nitrogen SupplyT3Ianta 196:288-294 ；andLhcbl*3::Nial*2(Arabidopsis thaliana)Nejidat, et al., (1997) “Increased protein content intransgenic Arabidopsis Thalinaover-expressing nitrate reductase activity’TlantScience 130:41-49。(参考文献)。尽管利用白花丹叶烟草植物中的35S CaMV::Nia-2基因检测到NR表达水平增加最多2-5倍((Foyer, et al., (1994) “Adaptations ofphotosynthetic electron transport, carbon assimilationand carbon partionng intransgenic Nicotiana plumbaginifolia plants tochanges in nitrate reductaseactivity”Plant Physiol.104:171-178),但没有观察到改善的氮效率。所有这些过表达这种酶的努力都没有导致在较低氮肥力(nitrogen fertility)下改善的生长。因此，尽管存在一些改善NR效率的努力，仍然没有提供导致生长，生产率和/或农业作物植物产量的改善的令人满意的组合物或方法。由于这些和其它原因，存在对于本专利技术的需要。专利技术简述本专利技术提供了当前NR序列的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。本专利技术提供了 NR基因的序列。本专利技术提出了改变作物植物，尤其是玉蜀黍的遗传组成的方法，以便这样的作物可以以目前的施肥更多产和/或以显著减少的肥料输入同样多产。因而本专利技术的这类应用不仅产量提高，而且肥料成本降低，相应的对环境的影响减小。因此，在一个方面，本专利技术涉及包含编码NR基因的分离的多核苷酸序列的分离的核酸。本专利技术的一个实施方式是包含选自由以下构成的组的核苷酸序列的分离的多核苷酸:(a)包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的核苷酸序列；；以及(c)包含与SEQ ID NO:U2、3、4、5或6具有至少70%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有增加的NR活性的多肽。本专利技术的组成包括包含选自由下列组成的组的氨基酸序列的分离的多肽:(a)包含 SEQ ID NO:7、8、9、10、11 或 12 的氨基酸序列以及(b)包含与 SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有增加的NR活性。在另一方面，本专利技术涉及包含所述的核酸的重组表达盒。另外，本专利技术涉及包含所述重组表达盒的载体。此外，包含所述重组表达盒的所述载体可以促进宿主细胞中所述核酸的转录和翻译。本专利技术还涉及能够表达本专利技术的多核苷酸的宿主细胞。可以使用许多宿主细胞，例如但不限于，微生物、哺乳动物、植物、或昆虫。在另一实施方式中，本专利技术针对转基因植物或植物细胞，包含本专利技术的核酸。包含本专利技术的多核苷酸的优选的植物包括而不限于:玉蜀黍(maize)、大豆、向日葵、高粱、油菜(canola)、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、番爺、及黍(millet)。在另一实施方式中,所述转基因植物是玉蜀黍植物或植物细胞。另一实施方式是来自可操作地连接到驱动在植物中的表达的启动子的本专利技术的转基因NR多肽的转基因种子。本专利技术的植物可以具有与对照植物相比改变的NR。在一些植物中，NR在营养组织、再生组织、或者营养组织和再生组织中是改变的。本专利技术的植物可以具有下列表型的至少一个，所述表型包括而不限于:提高的根质量、提闻的根长度、提闻的叶子大小、提闻的糖(ear)大小、提闻的种子大小、提闻的胚乳大小、和提闻的生物量。本专利技术的另一 实施方式将是在基因组基因座处被遗传修饰的植物，其中所述基因组基因座编码本专利技术的NR多肽。提供了用于提高植物中NR多肽的活性的方法。所述方法可以包括将本专利技术的NR多核苷酸引入植物中。提供了用于减少或消除植物中NR多肽的水平的方法。所述多肽的水平或活性还可以在特定组织中被减少或消除，造成植物生长，生长速率或氮利用效率(NUE)的改变。减少NR多肽的水平和/或活性可以导致植物的较小的高度(stature)或较慢的生长。附图简述本专利技术可从下列详细描述和构成本申请一部分的所附附图和序列表被更充分地理解。图l.Porphyra perforata(PpNR SEQ ID NO:5)和条斑紫菜(P.yezoensis) (PyNRSEQ ID NO: 10)之间的肽序列比较。PpNR和PyNR具有大约94%同一性。相同的氨基酸残基为粗体形式，类似的氨基酸为下划线形式。图2.从Pichia angusta中基于已公开的序列(GenBank登录号Z69783)克隆的酵母硝酸转运蛋白YNTl。来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的组成性启动子甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAP)驱动的具有组氨酸营养缺陷型选择标记物的YNTl (p3.5GAP-YNT1)利用毕赤酵母EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)被整合入巴斯德毕赤酵母菌株KM71 (Invitrogen)的His4基因座。通过PCR，重组菌株被确认为携带YNTl表达盒。包含YNTl的KM71系被利用被GAP启动子驱动的具有zeocin选择标记物的来自Porphyra perforate的硝酸还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的硝酸还原酶（ＮＲ）多核苷酸，其包含选自由下列组成的组的成员：（ａ）．编码ＳＥＱＩＤＮＯ：７，８，９，１０，１１或１２的多肽的多核苷酸；（ｂ）．包含ＳＥＱＩＤＮＯ：１，２，３，４，５或６所示序列的多核苷酸；和（ｃ）．包含长度至少３０个核苷酸的多核苷酸，其在严格条件下与（ａ）或（ｂ）的多核苷酸杂交，其中所述条件包括在３７℃在４０到４５％甲酰胺，１ＭＮａＣｌ，１％ＳＤＳ中杂交并且在５５到６０℃，在０．５Ｘ到１ＸＳＳＣ中洗涤；和（ｄ）．与ＳＥＱＩＤＮＯ：１，２，３，４，５或６具有至少７０％序列同一性的多核苷酸，其中序列同一性百分比是基于全部编码区并且通过ＢＬＡＳＴ２．０在缺省参数下确定的，其中所述多核苷酸编码具有硝酸还原酶（ＮＲ）活性的多肽；和（ｅ）．作为遗传密码的结果来自（ａ）到（ｅ）的任一的分离的多核苷酸简并物；（ｆ）．与（ａ）到（ｅ）的任一的多核苷酸互补的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DF卢塞尔特，D奥奈尔，CR西蒙斯，H王，
申请(专利权)人：先锋高级育种国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]