【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脲酶米氏常数测定方法,属于生物化学和应用酶学
技术介绍
脲酶又称酰胺基水解酶,广泛存在于各种细菌、真菌、植物、动物和人体中, 可以快速催化尿素水解生成氨和二氧化碳。脲酶的催化特性在各个领域被广泛的研究:医学上, 脲酶与肾炎、肝昏迷和消化溃疡等发病机理密切相关;农业上, 尿素的过快水解易导致植物幼株的氮中毒或碱诱导植物的损害;尿素的非生产性对环境也造成了一定的污染,因此对脲酶进行研究具有重要的意义。米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S]) 是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V(有些资料中也称为Vo)与底物浓度[S]关系的方程,此方程中,Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度,Km值称为米氏常数,代表了酶与底物的结合能力,是酶重要的特征参数之一,Km值等于酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。通常通过米氏方程转化得到的双倒数方程1/V=Km/(Vmax [S])+1/Vmax能够测定脲酶的Km值。具体方法是通过酶促反应速率的倒数1/ V对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图,得到直线在X轴上的截距为-1/Km,从而可以进一步计算得到Km的值。脲酶米氏常数的测定是高等院校生物化学和应用酶学等课程经常开设的实验项目之一,也是对脲酶进行研究的必要手段,米氏常数的测定受多种因素的影响,比如底物浓度、测试时间及酶浓度等,如果测试条件不合适,测得的数据会与实际值相差比较大。目前测定脲酶米氏常数一般采用脲酶-靛酚法,该方法步骤多、测试时间长。 ...
【技术保护点】
一种脲酶米氏常数测试方法,其特征在于:以一系列不同浓度的尿素为底物,酚红为指示剂,脲酶分解尿素产氨,pH值上升,在酚红指示剂的作用下,体系的颜色变深,吸光度的增加,吸光度的增加与酶促反应速度成正比,以吸光度的增加代表反应速度,用吸光度增加值的倒数1/△A代替双倒数方程中的1/V,对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图,根据双倒数方程1/V=Km/(Vmax[S])+1/Vmax可得直线在X轴上的截距即为‑1/Km,求得Km值。
【技术特征摘要】
1.一种脲酶米氏常数测试方法,其特征在于:以一系列不同浓度的尿素为底物,酚红为指示剂,脲酶分解尿素产氨,pH值上升,在酚红指示剂的作用下,体系的颜色变深,吸光度的增加,吸光度的增加与酶促反应速度成正比,以吸光度的增加代表反应速度,用吸光度增加值的倒数1/△A代替双倒数方程中的1/V,对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图,根据双倒数方程1/V=Km/(Vmax[S])+1/Vmax可得直线在X轴上的截距即为-1/Km,求得Km值。
2.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法,其特征在于:配制的脲酶溶液活力单位为10kU/L左右。
3.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法,其特征在于:使用系列浓度梯度的尿素缓冲溶液为底物,尿素浓度为4-20mmol/L ,一般浓度设置为4、5、6.67、10、15和20mmol/L。
4.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法,其特征在于:各种不同浓度的尿素溶液均以pH值6.8的磷酸缓冲液的配制。
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【专利技术属性】
技术研发人员:盛桂华,陈相飞,胡晓明,徐英,韩艳伟,陈杰,王峰,朱海亮,
申请(专利权)人:山东理工大学,
类型:发明
国别省市:山东;37
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