本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、谷胱甘肽、硒化物、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定
技术介绍
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。 现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这 些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。 氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价 格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很 多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法 简便、成本低的特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实 现该方法的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或 半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到 切实的推广应用。 本专利技术氨基酸浓度测定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+过氧化氢 过氧化氢+2谷胱甘肽谷胱甘肽讨氣化物酶/Se21谷胱甘肽二硫 +2水 谷胱甘肽二硫+还原型辅酶谷胱甘肽-二硫还原酶2谷胱甘肽 +辅酶 这种方法应用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)酶 (偶)联谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase ;EC 1. 11. 1. 9)、谷胱甘肽二硫还 原酶(glutathione-disulfide reductase ;EC 1.8.1.7)酶促反应比色法。氨基酸氧化酶 酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合谷胱甘肽过氧化物酶(受硒化物激活)、谷胱甘肽二硫还原酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量 340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨基酸的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术氨基酸诊断/测定试剂(盒)较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 还原型辅酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 谷胱甘肽过氧化物酶8000U/L 谷胱甘肽二硫还原酶10000U/L 谷胱甘肽 8mmol/L 石西化物 3mmol/L 本专利技术的氨基酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫 还原酶、谷胱甘肽、硒化物。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽、硒化物。 试剂2 缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫还原酶。 还原型辅酶、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫还原酶、谷胱甘 肽、硒化物在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷胱甘肽、硒化物。 试剂2 缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫还原酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。 还原型辅酶、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫还原酶、谷胱甘 肽、硒化物在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定氨基酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进-实施例一-步的说明, 本实施例的氨基酸诊断 三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂 还原型辅酶测定试剂为单试剂，包括盐酸缓冲液100mmol/L 500,1/L 0. 25,1/L 6000U/L 8000U/L 10000U/L 8mmol/L 3mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨基酸的浓度大小。 实施例二谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽二硫还原酶谷胱甘肽硒化物 本实施例的氨基酸诊断 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷稳定剂还原型辅酶谷胱甘肽硒化物试剂2三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂测定试剂为双试剂，包括盐酸缓冲液100mmol/L 50mmol/L 0. 25,1/L 8mmol/L 3mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽二硫还原酶盐酸缓冲液lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L 10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为 2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨基酸的浓度大小。 实施例三本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol,稳定剂 50mmol/L还原型辅酶 0. 25mmol/L谷胱甘肽 8mmol/L硒化物 3mmol/L 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol,稳定剂 500mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸浓度测定方法，其方法如下： 氨基酸＋水＋氧 氨基酸氧化酶 氧代酸＋氨＋过氧化氢 过氧化氢＋２谷胱甘肽 谷胱甘肽过氧化物酶／Ｓｅ↑［２＋］ 谷胱甘肽二硫＋２水 谷胱甘肽二硫＋还原型辅酶 谷胱甘肽二硫还原酶 ２谷胱甘肽＋辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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