本发明专利技术提供了一种肿瘤标志物ＡＭＰ－１８抗原多肽，其具有序列表中ＳＥＱ？ＩＤ？Ｎｏ．１所示氨基酸序列。本发明专利技术还公开了用其基因克隆表达该蛋白，运用免疫印迹和ｃｏｎｆｏｃａｌ两种不同的实验技术都获得同一结论，ＡＭＰ－１８能够与胃粘膜上皮细胞相结合，是该细胞的一个自分泌蛋白质，并且进行胃癌生物学行为判断和动物实验。由本发明专利技术所述的ＡＭＰ－１８具有很好的抑瘤作用，ＡＭＰ－１８抗原多肽可用于制备治疗肿瘤药物的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种AMP-18抗原多肽，更具体地说是一种肿瘤标记物AMP-18抗原多肽，自身抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用，属于生物工程领域。
技术介绍
胃癌是严重危害人群健康最常见的肿瘤之一。其发病率和致死率仅列于肺癌之后，位居癌症死因的次位。目前，世界上治疗肿瘤的主要方法是手术、放疗、化疗和生物治疗等四种。从医学角度看，至今肿瘤的治疗没有一种完全有效的手段，尤其是已经发生转移的肿瘤患者，传统的治疗方法无法控制肿瘤的全身扩散。研究证实，肿瘤直径与手术后5年生存率密切相关，肿瘤直径< 2cm，5年生存率100%，肿瘤直径每增加lcm，5年生存率下降20%。所以早期诊断，甚至在原位癌阶段诊断对于提高癌症治愈率极具重要意义。 近年来，肿瘤的靶基因研发为本领域的研究热点。根据迄今对肿瘤分子生物学的研究，与肿瘤发病相关的基因主要是两类，即癌基因和抑癌基因。 一些众所周知的抑癌基因是细胞周期的重要调控者，将它们的野生型转入肿瘤细胞可明显抑制其恶性程度，靶向抑癌基因的基因药物是癌症研究的热点之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种特异性肿瘤标志物AMP-18抗原多肽及其衍生物。 本专利技术的第二目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸。 本专利技术的再一个目的是提供该在AMP-18抗原多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。 为了实现上述目的，本专利技术专利技术思路为利用蛋白质组学技术筛选出胃癌相关蛋白AMP-18，并利用原核表达体系克隆表达该基因。因该基因为一分泌型蛋白质，故我们将其作为药物加入细胞培养基中，观测其对胃癌细胞系的生物学功能。可应用于临床诊断和研发药物的靶标。 本专利技术的具体技术方案 —种AMP-18抗原多肽，其具有序列表中SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。 上述的一种AMP-18抗原多肽的衍生序列，其是由SEQ ID No. 1所示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列，即在序列前端加入6个his。 —种多核苷酸，其特征在于，编码上述SEQ ID No. 2多肽的多核苷酸。 AMP-18抗原多肽其是以正常胃组织为模板，根据AMP-18基因序列设计特异引物，引物两端连入Sal I和Xho I酶切位点 上游弓l物5， _Tgaaggatccaactataatatcaacgtc_3， 下坊,弓l物5， _Aaatgtcgacgttctccaccgtgtctcc_3， PCR扩增出去除AMP-18信号肽序列的基因，经双酶切后与pQE30a连接，化学转化感受态细胞DH5 a ，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。筛选得到阳性克隆，lmmol/3L IPTG诱导表达。诱导以后的菌株经超声后离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结 果显示表达的产物为非可溶性蛋白。大量摇菌后进行诱导表达，提取可溶的蛋白过镍柱进 行纯化，50mM咪唑洗脱，SDS-PAGE电泳。 利用胶图分析和质谱鉴定，以及组织芯片和免疫组化相结合的方法进行鉴定，结 果显示AMP-18在正常组织中高表达，在相应的癌组织中不表达或低表达，结果具有统计学 意义。 构建pEGFP-AMP-18真核表达质粒，并将其及空载体转染至胃癌细胞系BGC_823。 利用免疫印迹法检测AMP-18的蛋白表达。结果显示在细胞及培养基中均可检测到AMP-18 的表达。这意味着AMP-18蛋白质是可能被分泌到细胞外的。运用免疫印迹和confocal (激 光共聚焦扫描显微技术)两种不同的实验技术都获得同一结论，AMP-18能够与胃粘膜上皮 细胞相结合，是该细胞的一个自分泌蛋白质。根据该特性，AMP-18与肿瘤细胞接触后，可直 接作用于细胞，说明可将AMP-18制作成治疗肿瘤的药物。 应用MTT(检测细胞生存生长)Brdu掺入实验(检测细胞增殖)、集落生成实验 (检测细胞集落形成能力)检测了 AMP-18对胃癌细胞系BGC-823的增殖影B向，结果显示， AMP-18对肿瘤细胞BGC-823具有生长抑制作用。通过AMP-18裸鼠体内实验发现经AMP-18 处理后，肿瘤细胞的恶性程度降低，增殖指数下降。说明AMP-18对肿瘤有抑制作用。 上述的AMP-18抗原多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中所述药物由有效量 的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示的AMP-18抗原多肽和一种或多种药学上可接受的载体 或赋型剂组成。 本专利技术的优点及有益效果 (1)本专利技术AMP-18抗原多肽具有极强的特异性，为肿瘤标志物。 (2)此外，本专利技术AMP-18抗原多肽还可以作为新药研发的靶标，用于制备抗肿瘤药物，并且具有很好的抑瘤作用。 下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，以使本领域技术人员可以 更清楚地得知本专利技术的技术方案，并非对本专利技术的限制。附图说明 图1是胃癌组织(T)及癌旁正常组织(N)表达差异蛋白及AMP-18的鉴定。图1_A 是癌组织及癌旁正常组织蛋白差异表达谱；图l-B是AMP-18在八对组织中的表达情况；图 1-C是AMP-18 二级质谱鉴定结果； 图2是免疫组化法检测AMP-18在胃癌配对组织中的表达； 图3是免疫印迹法检测AMP-18在细胞及培养基中的表达； 图4是pEGFP-AMP-18与高尔基体的共定位； 图5A是外源AMP-18在细胞中的表达图5B是免疫荧光定位外源AMP-18 ; 图6是外源性AMP-18对BGC-823的抑制作用。图6A是MTT ;图6B是Brdu掺入 实验；图6C是集落生成实验； 图7是外源性AMP-18在体内对于肿瘤细胞的作用； 图8是肿瘤组织经AMP-18处理后HE染色。具体实施方式 实验材料 本试验所用胃癌组织标本来源于北京大学临床肿瘤学院组织标本库。手术前停止供血30分钟，切除的新鲜胃癌组织与其对应的癌旁组织经生理盐水洗涤后，放入液氮保存。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。 具体步骤 实施例1 AMP-18抗原多肽的制备 1、蛋白质的提取 液氮冻存的组织经金属研钵研磨后，10% TCA/丙酮沉淀静置2h，在4t:条件下，35000g离心15min，弃上清。沉淀经_20°C预冷的丙酮清洗三次后真空干燥，用lysisbuffer (8M urea， 4 % CHAPS， 0. 5 % Ampholyte (3-10) ， 20mM Tris pH8. 5，用时加入2mMEDTA，lmM PMSF， 10mM DTT，Protease Inhibitor Cocktail)复溶，超声5分钟，在15。C条件下，40000g离心30min，取上清作为实验所用蛋白。 2、蛋白质的分离 蛋白质经过Bradford法定量后，应用双向电泳进行分离。胶条为18cm、 pH3_10，聚焦过程设置如下0V*4h， 50V*8h， 500V*lh， 1000V*lh， 8000V*lh， 8000V, 60， OOOVhr。聚焦后，胶条用分别含有1% DTT和2. 5% IAM平衡液平衡15分钟，转至12% SDS-PAGE进行分离。电泳结束后采用银染显色，如图IA所示。 3 、胶图分析和质谱鉴定 银染的胶图经扫描仪扫描后，采用ImageMaster 2D Plati皿m分析软件进行分析，设定3倍以上的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＡＭＰ－１８抗原多肽，其特征在于，其具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示氨基酸序列。
【技术特征摘要】
一种AMP-18抗原多肽，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的AMP-18抗原多肽，其特征在于，所述的AMP-18为自分泌蛋白。3. 根据权利要求1所述的一种AMP-18抗原多肽，其特征在于，其是由SEQ ID No. 1所 示氨基酸序列经氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。4. 一种多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸，如SEQ IDNo. 2 所示的碱基序列。5. —种t-AMP-...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢蕊，张军，康滨，刘斯奇，吕有勇，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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