一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，包括一个纤维素膜，所述的纤维素膜上设置有一条检测线和一条质控线，在靠近质控线的一侧的纤维素膜上设置有吸水垫，在靠近检测线的一侧的纤维素膜上设置有金标垫，所述的金标垫上设置有样品垫，本发明专利技术还提供了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备方法，本发明专利技术的免疫层析试纸敏感性及特异性高，实验室考核结果显示，本发明专利技术的免疫层析试纸可用于检测１０６－７ｃｆμ／ｍｌ霍乱弧菌菌悬液标本，并且不与其他生物发生交叉反应，检测方法简单、快速，同时本发明专利技术的制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种检测试纸，具体来说是一种 检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法。
技术介绍
霍乱弧菌可通过消化道传染。因此，开发出霍乱弧菌的快速检测技术 也是防生物战和反生物恐怖袭击的需要。由于霍乱弧菌无荚膜。在应对霍乱弧菌引起的生物危害突发事件种， 霍乱弧菌病原体的快速检测显得尤为重要。目前，其快速检验方法主要有 以下几种(1 ) 凝集将患者粪便放于5ml含特异性抗霍乱弧菌血清的碱性蛋 白胨水中37° C下孵育2-7小时，可见霍乱弧菌凝块沉在试管底部。(2)显微镜暗视野检察经蛋白胨水增菌后可利用该技术检査病原 体。在实践中，上述霍乱弧菌的检测方法暴露出一些共同的劣势，如费时 费力，敏感性低，而且需要技术熟练的操作人员和特殊的仪器设备，此外， 还常受到血片制作、染色质量和镜检人员专业水平等主客观因素影响而容 易引起误诊或漏诊，为使结果可信，常需要进行多次预试验和设立多项对照，试验操作繁琐，至少需要2小时以上，不适于现场及基层大规模使用，亦不能达到现代霍乱控制、监测、药物试验和疫苗研究的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方 法，所述的这种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸及其制备方法要解决现有技术中的检测测霍乱弧菌的方法费时费力、敏感性低、不能大规模检测的技 术问题。本专利技术提供了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，包括一个纤维素膜， 所述的纤维素膜上设置有一条检测线和一条质控线，在靠近质控线的一侧 的纤维素膜上设置有吸水垫，在靠近检测线的一侧的纤维素膜上设置有金 标垫，所述的金标垫上设置有样品垫。进一步的，金标垫上含有霍乱弧菌特异性抗体标记胶体金探针进一步的，所述的检测线含有霍乱特异性抗体；所述的质控线含有能 与所述霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体。进一步的，所述的霍乱弧菌特异性抗体可以为古典生物型、小川血清 型霍乱弧菌，古典生物型、稻叶血清型霍乱弧菌，埃尔托生物型、小川血 清型霍乱弧菌和埃尔托生物型、稻叶血清型霍乱弧菌中的一株或几株的全 菌体为抗原，免疫动物得到的抗体。当用几株的混合物来免疫动物时，得到的抗体能够更广谱，适用性会 更广泛。但是用一株来免疫动物时，也应该能够达到本专利技术的目的，因为 不同型的霍乱弧菌还是具有很多相同的抗原决定簇的。所述免疫动物的选 择是多种多样的，如兔、羊、马、鸡或鼠等常用的免疫动物，优选为兔；进一步的，所述霍乱弧菌特异性抗体的抗抗体优选为抗兔抗体。所述 检测线含有的霍乱弧菌特异性抗体的浓度可为3-5mg/ml，所述质控线含 有的能与霍乱弧菌特异性抗体特异结合的抗抗体的浓度可为3-5mg/ml。所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。 本专利技术还提供了一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备方法，包括一个 制备霍乱弧菌特异性抗体步骤， 一个制备免疫胶体金探针的步骤， 一个制 备金标垫的步骤，在所述的制备金标垫的步骤过程中，将设置在所述的金 标垫中，包括一个制备纤维素膜的步骤，在所述的纤维素膜上设置有一条 检测线和一条质控线的步骤，在靠近质控线的一侧的纤维素膜上设置有吸水垫，在靠近检测线的一侧的纤维素膜上设置有金标垫， 一个在所述的金 标垫上设置有样品垫的步骤。本专利技术的试纸利用了免疫胶体金技术及双抗体夹心检测法，用其检测 霍乱弧菌或霍乱弧菌抗原的基本原理是用霍乱弧菌特异性抗体包被纤维 素膜，用以捕捉标本中的霍乱弧菌或霍乱弧菌抗原，然后用标记了霍乱弧 菌特异性抗体的抗抗体的免疫胶体金探针进行检测。本专利技术和己有技术相对比，其效果是积极和明显的。本专利技术的免疫层 析试纸具有以下优点l)敏感性及特异性高实验室考核结果显示，本专利技术的免疫层析试纸可用于检测106-7cfp/ml霍乱弧菌菌悬液标本，并且不 与其他生物发生交叉反应；2)检测方法简单、快速检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的霍乱弧菌或霍乱弧菌抗原经过5分钟后的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为霍乱弧菌病的治疗争取了时间，和适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于 进行工业化生产，本专利技术将在霍乱弧菌的检测及其相关的疾病的诊断和治 疗中发挥重要作用，应用前景广阔。 附图说明图1是本专利技术一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的平面结构示意图。 图2是本专利技术一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的纵向剖面结构示意图。具体实施例方式实施例1检测霍乱弧菌的免疫层析试纸的制备 1、 霍乱弧菌特异性抗体的制备本实施例采用霍乱弧菌全菌体为抗原制备霍乱弧菌特异性抗体，具体方法如下1)霍乱弧菌抗原的制备6将霍乱弧菌860084(古典生物型,小川血清型)，860072(古典生物型,稻叶血 清型)，860103(埃尔托生物型,小川血清型)和860120(埃尔托生物型，稻叶血 清型)的冻干菌种(购自军事医学科学院微生物研究所微生物检验研究中心) 接种于TCBS琼脂培养基(中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责 任公司)中,在37"C ,5%。02孵箱中培养24小时,观察平板上菌落形态，挑取 四株菌典型的单个菌落，分别转种至碱性蛋白胨培养基(中国检验检疫科学 研究院北京陆桥技术有限责任公司生产)，在37°C ，5%002孵箱中培养24 小时，进行细菌形态学观察，血清学实验以及应用法国梅里埃公司 (bioMerieux) API 20E系统进行细菌鉴定，结果如下形态特征:霍乱弧菌为革兰氏染色阴性,呈香蕉状或逗点状,单端偏生菌毛 不形成芽孢和荚膜，液滴观察运动极为活泼.培养特征:霍乱弧菌在碱性蛋白胨培养基上有氧生长良好,菌落属光滑型, 边缘整齐，圆润，透明，扁平，微带蓝灰色乳光.血清学试验:与霍乱弧菌标准血清凝集良好.生化鉴定:使用法国生物梅里埃公司API 20E系统鉴定为霍乱弧菌.对鉴定后的四株霍乱弧菌进行扩大培养，具体方法为:培养24-28小时后, 用无菌生理盐水从培养斜面上洗下四株菌的菌苔，收集菌液，沸水浴3小时， 冷却至室温,用无菌生理盐水调菌浓度为2x108cf u菌/ml,将四株菌的菌液 等比混合后，即为霍乱弧菌抗原，《C保存.2)霍乱弧菌特异性抗体的制备选用体重2Kg健康雌性大耳白家兔(购自中国人民解放军军事医学科学 院动物中心,实验前测定家兔的自然抗体，有自然抗体者淘汰)，首次用福氏 完全佐剂与步骤1)获取得的霍乱弧菌菌体抗原混合乳化后皮下多点注 射，2x10Scfix菌/1ml/只,然后分别于初次免疫后第20日,第30日,第40日追 加免疫水剂1针，追加剂量和途径与初次免疫相同，末次免疫后10天试血， 用玻片凝集试验检测血清效价，结果效价大于1:640，颈动脉取血，离心收集板脱盐后收集抗体.采用紫外分光光度仪测定抗体浓度，方法:将纯化抗体适当稀释 后，分别在280nm及260nm波长下测定A，代入公式蛋白含量 (mg/ml)-(1.45xA28o師-0.74xA26,)x稀释倍数，计算得到蛋白的浓度.结果按照上述方法纯化所得的抗体蛋白浓度约为10mg/ml. 2.制备免疫胶体金探针用下述方法制备霍乱弧菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针1) 制备胶体金溶液采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测霍乱弧菌的免疫层析试纸，包括一个纤维素膜，其特征在于：所述的纤维素膜上设置有一条检测线和一条质控线，在靠近质控线的一侧的纤维素膜上设置有吸水垫，在靠近检测线的一侧的纤维素膜上设置有金标垫，所述的金标垫上设置有样品垫。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛海鹏，
申请(专利权)人：上海海泰金芯生物分子检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]