一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法技术

本发明专利技术属于分子生物学ＤＮＡ标记技术领域，涉及一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法，利用仿刺参ＥＳＴｓ序列和微卫星检索软件进行微卫星位点查找，对二碱基大于７次、三碱基大于５次、四碱基大于５次、五碱基大于３次和六碱基大于３次重复的微卫星片段分离，得到含有微卫星重复序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，优化成为微卫星标记；再在扩增过程中重复性、稳定性和多态性信息含量值进行评价，得标准微卫星标记评价体系；其设计原理安全可靠，标记方法简单易行，对仿刺参筛选和进行微卫星标记效果好，应用前景广阔，社会经济效益明显。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法，包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和标准微卫星位点确定四个步骤，其特征在于：　　（１）微卫星位点来源：　　利用微卫星检索软件Ｒｅｐｅａｔ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１．５对ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）进行微卫星ＤＮＡ的查找，对二碱基重复大于７次、三碱基重复大于５次、四碱基重复大于５次、五碱基重复大于３次和六碱基重复大于３次的微卫星片段进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列，采用软件ＢｉｏＥｄｉｔ像并对电泳带谱利用公式ＰＩＣ＝１－∑Ｐｉ↑［２］进行计算，其中Ｐｉ是第ｉ个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件ＰＯＰＧＥＮＥ３２计算得出；根据ＰＩＣ值的计算结果，去除重复性、稳定性差，ＰＩＣ小于０．２５的标记，最终筛选得到重复性、稳定性好，ＰＩＣ值大于０．２５的位点１１个，作为仿刺参标准微卫星评价体系，用于仿刺参的种质资源评价。对含有微卫星位点的ＥＳＴｓ序列进行聚类分析，选取不重复的序列设计引物；　　（２）引物设计：　　在微卫星重复的侧翼序列利用软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０和Ｏｌｉｇｏ　６．４４设计引物，引物设计采用以下严谨度：①引物长度为１９－２５ｍｅｒ，②ＧＣ含量４０％－６０％，③退火温度４５－６５度，④预期ＰＣＲ产物长度为１００－４００ｂｐ；　　（３）引物优化：　　不同引物根据不同Ｔｍ值，在温度梯度ＰＣＲ仪上进行温度梯度优化，扩增反应采用Ｂｉｏｍｅｔｒａ　Ｔ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ　ＰＣＲ系统，ＰＣＲ程序为：９５℃变性４５ｓ，退火４５ｓ，７２℃延伸４５ｓ，反应进行３０个循环；首次循环前９５℃预变性５ｍｉｎ；最后一次循环结束后７２℃再延伸５ｍｉｎ，反应体系为２０μｌ，含有１×ＰＣＲ反应缓冲液，０．２ｍＭ的ｄＮＴＰｓ，１．２ｍＭ的Ｍｇ↑［２＋］，各０．２μＭ的正、反引物，１Ｕ的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，８０ｎｇ的模板ＤＮＡ，该模板是从４８个个体中任取５个个体的ＤＮＡ等量混合得到，扩增得到的ＰＣＲ产物用１０％的聚丙烯酰胺凝胶电泳－ＥＢ染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的ＰＣＲ反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ｔａ；　　（４）标准微卫星位点确立：　　微卫星位点的多态性水平用多态信息含量值衡量；多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当ＰＩＣ＞０．５时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡景杰，彭薇，包振民，黄晓婷，陆维，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]