橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法技术

本发明专利技术涉及一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生体胚植株的方法，是选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导产生的子叶胚为外植体，进行切片处理，然后将切片接种到胚性愈伤诱导培养基上进行暗培养得到脱分化愈伤；将脱分化愈伤接到胚诱导培养基上进行暗培养产生的子叶胚；将子叶胚接到自根苗培养基上进行光培养。本发明专利技术在橡胶树花药组培或内珠被组培的基础上利用子叶胚高效胚性愈伤诱导出胚，可大大提高形成子叶胚的效率，而且不受花期、果期及气候等自然条件的制约，具有工艺简单，生产成本低，子叶胚增殖率高，组织培养周期短等特点，具有很大的应用价值，也为橡胶转化体系的建立开创了展新的技术路线。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生体胚植株的方法。
技术介绍
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)属橡胶树属大戟科，是热区广泛种植的重要经济作物，因其胶乳产量高、质量好、易于获取而具有商业开发价值，成为世界上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生乔木，常规育种周期长，选育种受到很大的限制。为了拓宽巴西橡胶树育种途径，改良其品质，从上个世纪50年代以来，橡胶育种学家们即开始着手研究其组织培养技术，特别是上个世纪70年代以来，我国、马来西亚、法国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡等国投入大量的人力、物力、财力对这项技术进行广泛的研究，目前在花药培养、未授粉胚珠和子房培养、茎尖及嫩茎培养、悬浮细胞培养、原生质体培养、体细胞植株的克隆增殖和遗传转化等方面都取得了一定的进展。 花药和内珠被培养是巴西橡胶树组织培养中研究较早和较多的方向，其基本过程是1)拨取橡胶处于单核晚期的雄花花药或切取幼嫩橡胶树种子的内珠被进行脱分化培养，约30 60天；2)将形成的脱分化愈伤转入橡胶胚诱导培养基，进行胚诱导培养过程，约3 4个月；3)经胚诱导过程后，会从部分脱分化愈伤上形成胚性愈伤，胚性愈伤经进一步发育会逐步形成棒状、心形、鱼雷形胚(以上为成熟胚)等，这些都是胚性组织；4)将成熟胚依次转入芽诱导和根诱导培养基内进行芽和根的培养，当长到适宜高度后再转入自然环境锻炼和定植。 迄今，我国花药和内珠被植株的大田栽培面积已有近千亩，与传统的芽接苗相比，花药和内珠被植株植株具有生长速度快、干胶产量高、抗逆性强的特点，未来可能成为主要的种植材料。目前，花药和内珠被植株培养中存在的主要问题是外植体取材受橡胶开花和结果时间的限制，脱分化愈伤成胚率低且难以长期继代保存，因而植株再生频率低，生产成本高，后期靠体胚植株茎段微繁技术也很难满足生产中对组培苗的大量需求和建立高效遗传转化体系等生物技术实验的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，它是选择适宜的子叶胚进行切片处理诱导高效的胚性愈伤，由胚性愈伤再诱导出大量子叶胚，并成苗的过程，该方法能大量长期继代增殖保存良好的胚性材料，大大提高了橡胶树的组织培养效率，为生产和实验提供了良好的再生体系方法。 本专利技术所采用的技术方案 —种，包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程、高效胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程。3 1、胚性组织的选取与处理过程在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康，长lcm以上的子叶胚为外植体，进行切片处理，切成宽2 3mm、长3 5mm的米粒状切片。切片的质量影响愈伤诱导效率，切片过小，难以诱导出愈伤，切片太大浪费材料的同时也难诱导出理想的愈伤。 2、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程将米粒状子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于26 28t:进行暗培养20 40天。其中20 30天的愈伤出胚效率最高，体胚愈伤在胚诱导培养基上培养45天后观察，出胚愈伤率可达40 60% ，出胚率可达200 300%，20天以前的愈伤量很少，40天以后的愈伤出胚效率明显降低，都不宜选择为胚诱导的愈伤材料。所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0. 5 2ppm2，4-D、0. 5 2卯m KT、0 l卯m BA、0 2卯m NAA、0 2卯m ZT、蔗糖70 90g/L、椰子水50ml/L、0. 1 2g/L天门冬酰胺和0. 1 0. 2g/L肌醇。 3、高效胚性愈伤诱导成胚过程将步骤2得到的脱分化愈伤接到胚诱导培养基上于24 26t:进行暗培养。20 30天可观察到体胚的发育过程，40 60天时能大量形成子叶胚。这些子叶胚长到lcm以上时便可进一步切片诱导高效胚性愈伤进行体胚的循环增殖，或 者接入成苗培养基内诱导形成自根苗。所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10 50%，微量元素增加0. 5 2倍，并添加0. 5 3ppm BA、0. 5 3卯m KT、0 0. 5卯mNAA、0. 2 lppmGA、0 .5卯m ABA、水解酪氨酸50 300mg/l、加0. 1 0. 2g/L肌醇、麦芽糖0 20g/L、蔗糖50 70g/L和椰子水50ml/L。 4、成熟胚的选取与诱导成苗过程选取步骤3诱导产生的健康、完整、高1. 5cm以上的子叶胚接到自根苗培养基上于28 3(TC进行光培养。约IO天子叶胚可抽出健状的主根，约20天子叶胚可抽出10cm的健状茎段。所述自根苗培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减少10 30%，并添加0 2卯m BA、0. 5 2卯m KT、0. 2 l卯m NAA、0. 5 1. 5卯mGA、糖30 50g/L和椰子水50ml/L。 本专利技术的优点 1、子叶胚诱导率低是橡胶树组培中存在的主要问题，也是制约橡胶树体细胞植株工厂化生产的瓶颈，利用子叶胚高效胚性愈伤诱导出胚，可大大提高形成子叶胚的效率，解决了橡胶树成胚率低和自根苗成苗率低的问题。橡胶的成胚过程，从大的方面需要经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚四个阶段，实验中专利技术人发现子叶胚以外的白色胚性组织包括畸形胚也能切片诱导出具有较高胚诱导效率的愈伤组织，但这些胚性组织诱导出的胚，胚性不稳定，产生畸形胚的比率很高；同时，子叶胚以前阶段的白色胚性组织个体较小，胚状体难以切片，并且浪费材料，因而不宜选择为外植体切片材料。子叶胚切片容易、切片均匀，诱导出的愈伤出胚效率高，并且几乎没有畸形胚的出现，能很好的保存形成子叶胚的能力，子叶胚成熟后进一步诱导成苗率可达80%以上。 2、花药或内珠被接种费工、费钱，还受花期、果期及气候等自然条件的极大限制，利用子叶胚切片诱导愈伤进行增殖可以弥补以上不足，长期保存健康的可利用组培材料，提高实验和生产效率。 3、传统的橡胶树组织培养从花药或内珠被接种到诱导出成熟的子叶胚一般需要150天，而本专利技术只需要100天就可得到成熟的子叶胚，大大縮短了成胚时间，提高了组织培养效率。 4、胚性组织成功继代增殖为橡胶转化技术提供了新的技术路线。从1994年 Arokiaraj等利用基因枪法枪轰击巴西橡胶花药脱分化愈伤组织获得了第一株转基因橡胶 植株以来，利用花药或内珠被脱分化愈伤进行转化成了巴西橡胶转化的基本技术路线。这 类转化路线实现转化过程长，仅从脱分化愈伤诱导成胚就需3 4个月，特别是农杆菌转化 的抑菌、筛选过程中长期使用大量抗生素，对愈伤的生长、胚性组织的诱导等产生较大的不 良影响，这些因素造成了转化后的愈伤成胚率极底。然而，子叶胚高效胚性愈伤出胚率高， 初步农杆菌转化实验证明其抗转化作用强，转化后仍能较快成胚。因此，为橡胶转化体系的 建立开创了展新的技术路线。 在橡胶树花药组培或内珠被组培的基础上，本专利技术工艺流程简单，生产成本低，子 叶胚增殖率高，组织培养周期短，具有很大的应用价值。附图说明 图1是本专利技术的愈伤诱导天数与出胚愈伤数的关系图。 图2是本专利技术的愈伤诱导天数与出胚率的关系图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例 1、在橡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法，其特征在于：包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程、高效胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程；１）、胚性组织的选取与处理过程：在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康，长１ｃｍ以上的子叶胚为外植体，进行切片处理，切成宽２～３ｍｍ、长３～５ｍｍ的米粒状切片；２）、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程：将米粒状子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于２６～２８℃进行暗培养２０～４０天；所述胚性愈伤诱导培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并添加０．５～２ｐｐｍ２，４－Ｄ、０．５～２ｐｐｍＫＴ、０～１ｐｐｍＢＡ、０～２ｐｐｍＮＡＡ、０～２ｐｐｍＺＴ、蔗糖７０～９０ｇ／Ｌ、椰子水５０ｍｌ／Ｌ、０．１～２ｇ／Ｌ天门冬酰胺和０．１～０．２ｇ／Ｌ肌醇；３）、高效胚性愈伤诱导成胚过程：将步骤２得到的脱分化愈伤接到胚诱导培养基上于２４～２６℃进行暗培养；所述胚诱导培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，其中大量元素减少１０～５０％，微量元素增加０．５～２倍，并添加０．５～３ｐｐｍＢＡ、０．５～３ｐｐｍＫＴ、０～０．５ｐｐｍＮＡＡ、０．２～１ｐｐｍＧＡ、０～．５ｐｐｍＡＢＡ、水解酪氨酸５０～３００ｍｇ／Ｌ、加０．１～０．２ｇ／Ｌ肌醇、麦芽糖０～２０ｇ／Ｌ、蔗糖５０～７０ｇ／Ｌ和椰子水５０ｍｌ／Ｌ；４）、成熟胚的选取与诱导成苗过程：选取步骤３诱导产生的健康、完整、高１．５ｃｍ以上的子叶胚接到自根苗培养基上于２８～３０℃进行光培养；所述自根苗培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，其中大量元素减少１０～３０％，并添加０～２ｐｐｍＢＡ、０．５～２ｐｐｍＫＴ、０．２～１ｐｐｍＮＡＡ、０．５～１．５ｐｐｍＧＡ、糖３０～５０ｇ／Ｌ和椰子水５０ｍｌ／Ｌ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，彭明，曾会才，王旭，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]