产皂甙元的盾叶薯蓣内生菌的筛选方法技术

本发明专利技术通过野外采样，样本表面消毒，菌种分离，液体培养等步骤获得一株盾叶薯蓣内生菌，经鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌，该菌株能产生盾叶薯蓣皂甙元，可以作为发酵用生产菌株。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产菌种，其是由盾叶薯蓣中分离得到的，并能产生皂甙元。
技术介绍
盾叶薯蓣是一种药用植物，传统中医学认为，盾叶薯蓣以根茎入药，其性 味苷、苦、凉。具有祛湿、清热解毒之功效，民间用于治疗皮肤急性化脓性感 染、软组织损伤、蜂蛰、虫咬及各种外科炎症，根状茎还有强身壮骨的作用。 近年来的研究表明，薯蓣有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用。皂甙元是薯蓣 的主要活性成分，也是我国由于合成多种甾体激素的重要前体，可以合成蛋白 同化激素、皮质激素、性激素等三大类数百种留体激素药物，是国内药品生产 中仅次于抗菌素的一个重要领域。我国目前生产皂甙元的方法主要是从盾叶薯蓣中直接提取。而随着医药工 业对皂甙元的需求量日益增加，人们加大了对薯蓣资源的开发力度，刺激了对 野生盾叶薯蓣的高速无节制利用，很多地方的掠夺式采挖，使野生资源逐渐枯 竭；而如果采用人工种植的方式， 一方面在盾叶薯蓣种植过程中的循环种一挖， 对其产区(主要是山区)脆弱的生态环境会造成严重的破坏，尤其是造成地表 植被破坏而引起水土流失，另一方面长期人工种植造成薯蓣种质资源退化，其 皂素含量不断降低。同时直接从薯蓣中提取皂甙元的生产工艺会产生大量废水，每生产1吨皂甙元平均排放废水450吨，这些废水有机污染物浓度高、酸度高、 色度高，处理难度极大。按照国家污染控制的有关要求，这些高污染企业必须 进行废水治理，达到国家一级排放标准，否则自行关闭。特别是在湖北、陕西、 河南等省盾叶薯蕷主产区，位于我国重点保护的水资源——南水北调中线水源 汉江上游地区，更加重了对皂素行业水污染控制的分量和紧迫性，对水资源的 威胁不容忽视。植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害而 与植物建立了和谐联合关系的微生物。植物内生菌的研究起始于19世纪中叶， 1993年Stierle首次报道了从短叶紫杉(rajo/s &，/0/&)的树皮中分离出一株内生 真菌能产生紫杉醇，掀起了从植物内生菌中寻找新物质的热潮。植物体内广泛 分布着内生细菌，其长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一 方面植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，内生菌又可通过自身 的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。内生菌对宿主植物的生 物学作用的物质基础，在于其自身合成的抗生素、激素酶抑制剂、诱导物等多种活性物质或通过诱导物(葡聚糖、糖蛋白、小肽、脱乙酰几丁质、花生四烯酸 等不饱和脂肪酸)胁迫宿主植物合成的萜类、生物碱、皂苷、黄酮、酚类和多炔 类等次生代谢产物。因此，利用植物内生菌发酵生产与植物相同或相似的次生 代谢活性产物是可能的，从特殊环境下的植物和传统的药用植物分离得内生菌， 再从内生菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物以创制 新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物，将在很大程度上丰富人类的 药物宝库，同时也有助于保护稀缺的植物资源以及避免脆弱的环境受到破坏。
技术实现思路
鉴于以上技术背景中所提出的盾叶薯蓣皂甙元生产中面临的一些问题以及 植物内生菌的知识，本专利技术的目的在于从盾叶薯蓣植株中分离得到能发酵生产 盾叶薯蓣皂甙元的内生菌。为实现以上目的，本专利技术的菌种通过以下步骤得到a. 从野外采集盾叶薯蓣植株；b. 选取健壮盾叶薯蓣的地下茎进行表面灭菌； C.将表面灭菌后的薯蓣地下茎进行内生菌分离；d. 将分离得到的内生菌进行液体培养；e. 对发酵产物提取结晶并检测，确认其为盾叶薯蓣皂甙元。步骤b所述表面灭菌方法为用无菌水将薯蓣地下茎冲洗干净,放入超净工作 台，剪成5cmX5cm小块，先在75%的酒精中浸泡30s,然后用0.1^HgC12溶液 浸泡3—5min,接着用无菌水冲洗3次。步骤c所述内生菌分离方法为将薯蓣地下茎切成0.5cm左右的小薄片，接 种于PDA平板培养基上。每个培养皿接种1—2片，做4个重复。置于28'C的 恒温培养箱中培养3 — 5d。然后根据细菌的菌落形状、大小，颜色和分布状况等， 用接种环从培养基菌落上挑菌少许到新的BPA培养基上，用划线分离法纯化2-3次，直到分离出纯菌种。步骤d所述液体培养的方法为将分离得到的菌种接入BPA液体培养基进行 液体培养，置于28'C的恒温摇床上培养，振荡频率为120r/min,培养一周。本专利技术得到一株能产生盾叶薯蓣皂甙元的盾叶薯蓣内生菌菌株Syb06.11.1，经鉴定为地衣芽孢杆菌(5^///1^&/^ ^0/7 &)。现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保存日期2008年1月10日，保存号2334，该菌种能用于发酵生产盾叶薯蓣皂甙元。附图说明保藏日期2008年1月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号2334。 具体实施例方式盾叶薯蓣内生菌的获得方法为a. 从野外采集盾叶薯蓣样本；b. 选取健壮盾叶薯蕷的地下茎用无菌水冲洗干净，放入超净工作台，剪成5cm X5cm小块，先在75%的酒精中浸泡30s,然后用0.1%HgC12溶液浸泡3—5min, 接着用无菌水冲洗3次。并分别用两种方法检验表面灭菌效果(1) 冲洗液法分别移取最后一次无菌水冲洗液于马铃薯葡萄糖琼脂培养 基平板上，在27'C恒温培养箱中培养3—5d，每个材料做2个重复，观察是否 有菌落产生。(2) 原材料法取灭过菌的原材料置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上， 在27"C恒温培养箱中培养3—5d，每个材料做2个重复，观察是否有菌落产生。若无菌落产生则证明表面灭菌彻底，否则该材料不能使用。c. 将表面灭菌后的薯蓣地下茎切成0.5cm左右的小薄片，接种于PDA平板培 养基上。每个培养皿接种l一2片，做4个重复。置于28T:的恒温培养箱中培养 3—5d。然后根据细菌的菌落形状、大小，颜色和分布状况等，用接种环从培养 基菌落上挑菌少许到新的BPA培养基上，用划线分离法纯化2-3次，直到分离 出纯菌种。d. 内生菌的液体培养采用BPA液体培养基。将500ml培养基倒入1000ml三 角摇瓶中，高压湿热灭菌30min后，在超净工作台上将筛选到的每种内生菌加 入一环到一个三角瓶中，每种做2个重复，置于28。C的恒温摇床上培养，振荡 频率为120r/min,培养一周。e. 将培养液中加入适量浓盐酸，使其发酵液中盐酸浓度为2mo1/1，水解4h， 冷却，加NaOH中和至PH中性为止。将发酵液于索氏提取器中以120#石油加 热回流提取4h后，取出发酵液用分液漏斗萃取，将发酵液与汽油层分离，取汽 油层浓缩后，过夜使其结晶，便得发酵产物晶体。将粗提取的皂式元过层析柱， 使得其中所含的混合物分离开来。柱层析后将所得到的洗脱液用浓硫酸显色法 检测，收集阳性洗脱液合并，结晶。通过NMR确定晶体结构。层析条件为吸附剂柱层析硅胶；洗脱剂石油醚乙酸乙酯=2: 1。权利要求1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株Syb06.11.1。现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保存日期2008年1月10日，保存号2334，其特征在于是能产生盾叶薯蓣皂甙元。2. —株地衣芽孢杆菌(Sac"/w/,c/^m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株Ｓｙｂ０６．１１．１。现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ），保存日期２００８年１月１０日，保存号２３３４，其特征在于是能产生盾叶薯蓣皂甙元。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宝福，李军超，徐虹，史鹏，张继文，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]