本发明专利技术是涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。本发明专利技术还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序列的方法及靶核酸序列的快速检测方法。本发明专利技术还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒 温扩增耙核酸序列的方法。本专利技术还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序 列的方法及耙核酸序列的快速检测方法。本专利技术还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原 微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。
技术介绍
近30年来，全球流行病趋势表明，难培养和不能培养的病原微生物己经 成为传染性和感染性疾病的主要根源。 一些常规的病原菌检测方法(例如， 大量增殖菌数、菌落纯化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴 定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经越来越跟不上人类对致 病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来 研究这些病原菌的核酸结构和分子特征，将对那些难以人工培养和不能人工 培养的病原微生物进行正确地鉴定起到重要作用，可以大大提高对病原菌的 检测和研究能力。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接检测 临床标本，在较短时间内得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛， 并有逐步替代传统的细菌或病毒培养的趋势。聚合酶链反应(PCR)技术是目前最成熟的核酸扩增技术，自它问世以来， 该技术就得到了极为广泛的应用和发展。目前，体外核酸扩增技术可分为两 大类， 一类如聚合酶链反应技术(PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction丄CR)禾口转录依赖的扩增系统(transcription based amplification system, TAS)等，这类技术的共同特点是均要进行几个保温点的循环。第二 类是恒温扩增系统，如链置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)，核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, 腦BA), 转录酶扩增技术 (Transcription Mediated Amplification, TMA)，滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification, RCA)，连环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),解 链酶扩增技术(Helicase D印endent Amplification, HDA)等。这类技术的 共同特点是扩增反应均在一个特定温度下进行，从而大大降低了对仪器的要 求。由于目前各种体外核酸扩增技术大多需要与电^C、荧光、质谱法或直接 测序等方法结合来进行检测。这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是 以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此并不适合于在 基层医院进行广泛的应用和推广。本专利技术是结合了先进的恒温核酸扩增技术 和核酸试纸条快速检测技术而专利技术的一种操作简单、时间短、价格低廉的检 测技术。可以广泛地应用于所有与病原体检测等相关领域。下面就现有的主 要的几种扩增检测技术进行概述。1、 聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction ， PCR)聚合酶链式反应是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两 侧，从而酶促合成多个拷贝的靶序列DNA片段。PCR的每一循环都包括DNA 变性，引物复性和由咖A聚合酶催化的延伸反应。每次循环新合成的DNA片 段又可成为下次循环的模板，这就导致耙序列DNA的指数扩增。目前，PCR 技术被广泛的应用到生物技术的各个方面。例如，对遗传疾病或肿瘤癌症的 诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断；用于亲子关系的鉴定 等。2、 连接酶链式反应(ligase chain reaction, LCR)连接酶反应是基于Taq连接酶的连接能力的特异性，为了检出靶基因序 列中的点突变而设计的。连接酶反应识别点突变的特异性高于PCR,若耙序 列有点突变，则引物不能与靶序列精确结合，缺口附近的核苷酸空间结构发 生变化，则连接反应不能进行，也就不能产生扩增产物。目前该方法主要用 于点突变的研究与检测，如单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断, 微生物的种型鉴定和癌基因的点突变研究等。3、 滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification, RCA) 滚环复制技术分为线性和指数扩增两种。线性滚环复制只适用于环状核酸的扩增，其产物是具有大量与环状DNA互补的重复序列的DNA单链。线性滚 环复制非常适合于固相形式的微阵列的特异信号的检测。指数滚环复制时， 扩增产物也作为模板参与反应，因此能使得产物呈指 递增。同时指数滚环 复制也可用于非环状DNA的扩增。滚环复制技术特异性很高，可用于突变与SNP的检测，若与荧光实时检测系统结合起来，其应用前景将是很广的。4、 转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification, TMA)转录酶扩增技术是一种在逆转录酶和T7 RNA多聚酶的共同作用下，在等 温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统。其扩增原理为目标序列在逆转录酶 作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的 RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个 目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自 催化过程。该方法特异性强，灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，无需专门 的扩增仪器，且因整个反应在1个试管中进行，也减少了污染。5、 依赖核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)依赖核酸序列的扩增，又称自主序列复制系统(self-sustained sequence r印lication， 3SR)，主要用于RNA的检测。该反应有赖于逆转录酶，T7 RNA 多聚酶和核酸酶H,以及两条特殊的引物共同协作完成。引物I的3'末端与 靶序列互补，5'端含T7RNA多聚酶启动子，用于合成cDNA。引物II的序列 则与cDNA的5'未端互补。反应时，引物I先与RNA模板结合，在逆转录酶 的作用下催化合成cDNA，再由核酸酶H水解cDNA上的RNA,形成一条单链的 DNA;引物II与此cDNA的5'未端结合，并在逆转录酶的作用下合成第二条 DNA链。这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子。逆转录酶再以此 DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的新的RNA链。每条新的RNA又可 作为模板合成cDNA，如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA。NASBA操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环，同时由于外来双链DNA 无启动子序列，不能被扩增，这大大提高了反应的特异性。NASBA技术适于 检测和定量分析特异性RNA，也可应用于扩增双链DNA，因此在临床上有比较 广泛的应用。6、 链置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)链置换扩增技术主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶两种酶的共同 协作来完成。其过程主要包括单链DNA模板的准备、生成两端带酶切位点的 目的DNA片段、SDA循环三个阶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其特征为包括以下步骤： １）设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物； ２）在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板； ３）以线性结构和／或二级结构的方式进行扩增，通过引 物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：尤其敏，胡林，徐高连，石翊轩，
申请(专利权)人：杭州优思达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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