高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法。其组成：微球粒浓度为０．２～０．４％（ｗ／ｗ），０．１２Ｍ甘氨酸缓冲液ｐＨ７．２，乙二醇３０％（Ｖ／Ｖ），２ｍＭ　ＥＤＴＡ.２Ｎａ乙二胺四乙酸二钠盐，０．１％ＮａＮ↓［３］。制备包括以下步骤：载体免疫定量胶乳微颗粒的制备，抗体、抗原的制备，常温下加入ＥＤＣ，ｐＨ＜６．５条件下让羧基活化，行待一定时间后，将反应ｐＨ上调，减慢反应速度。与现有技术相比，由于采用了本发明专利技术提出的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法，提高了载体微颗粒直径的均匀度及抗原或抗体在颗粒表面分布的均匀度，同时还使包被的抗原或抗体在均相条件下的自由度增加，减少空间结合位阻，增加二级免疫反应速率，提高反应灵敏度，其检测的灵敏度比以往文献报道可提高１００倍。

【技术实现步骤摘要】

-本专利技术涉及一种高灵敏免疫胶乳定量比浊测定试剂，尤其是涉及该试剂的 制备方法。
技术介绍
-自上世纪80年代开发出直径小于200纳米的颗粒可作为免疫载体的均相化试剂以来，已开发出许多免疫测定项目，其优点如下 一是由于颗粒直径小于光波长的2/5，既可作为免疫物质载体，又不失为均相化试剂，在自动化定量操 作上具备明显的优势；二是免疫物质的固相化，降低被载物质抗原或抗体的自 由能，明显延长该物质免疫抗原或抗体活性，由于上述优势，目前已经有多个 免疫检测项目利用该技术成功研制出相当优秀的诊断试剂产品。但其不足之处 是在灵敏度上不及酶标记和荧光标记方法，对于含量甚低的蛋白原分子不能该 方法所检测，对于激素、药物类型小分子不能形成有效的免疫结合网络，故也 不能用该方法检测。同样，在使用单克隆抗体上也有一定困难，需要多个单克 隆抗体配组使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术不足之处而提供一种能对含量甚低的蛋白原 分子作检测的、对于激素、药物类型小分子能形成有效的反向免疫结合网络的 。本专利技术的目的是通过以下措施来实现 一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂 的制备方法方法，其特殊之处在于高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的组成R"微球粒浓度为0.2~0.4%(w/w), 0.12M甘氨酸缓冲液pH7.2,乙二醇 300/。(V/V), 2mM EDTA 2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.1°/。 NaN3) 其制备经过下列步骤制备-(1) 载体免疫定量胶乳微颗粒的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝 大部分氧气，经冷却后取750ml加入l.Og十二烷基磺酸钠SDS在65"C恒温10 分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98。/。的苯乙烯单体30ml，再将温 度上调至75°C，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml (pH调节至5.5-6.5)，平衡后 加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84'C，反应时间为30分钟，按微颗粒球 大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在 84'C老化两小时，自然冷却；(2) 抗体、抗原的制备由市购采得，按33% (W/V)硫酸铵饱和沉淀纯 化抗体；(3) 常温下在前述微颗粒球液中按1°/。浓度含有效羧基量为0.005mM计加 入水溶碳化二亚胺EDC， ( 0.005*192*40%) mg量，在pH<6.5条件下活化20 分钟，将pH上调至7.0-7.2,加入正氨基已酸(0.005*132*60°/。) mg量，在室 温下作用2小时将pH上调至7.5，在4。C过夜，次日对0.025M,pH7.0的NaCL溶液透析两次，备用；(4) 将上述已伸手臂的微球液按15。/。r(0.005H92"5Q/。)量加入EDC，活化 20分钟后，加入50%体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入 抗体液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0,置于4'C平衡过夜；次 日，将pH调至7.0,再置于4。C平衡过夜；48小时后，按2.0mg/P/。'ml的比例加入牛血清白蛋白(溶于0.025M，NaCL,pH6.8)封闭过夜，最后补加甘氨酸， 乙二醇，NaN3，使其最终浓度达到0.12M,30。/。，0.1。/。,pH7.4;在4。C中储存3日后待用。(5)完成制备。与现有技术相比，由于采用了本专利技术提出的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的 制备方法，提高了载体微颗粒直径的均匀度及抗原或抗体在颗粒表面分布的均 匀度，同时还使包被的抗原或抗体在均相条件下的自由度增加，减少空间结合 位阻，增加二级免疫反应速率，提高反应灵敏度，其检测的灵敏度比以往文献 报道可提高100倍。具体实施例方式本专利技术制备的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂用下列步骤制备(1) 载体免疫定量胶乳微颗粒的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝大部分氧气，经冷却后取750ml加入l.Og十二烷基磺酸钠SDS在65"C恒温10 分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98。/。的苯乙烯单体30ml，再将温 度上调至75°C，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml (pH调节至5.5-6.5),平衡后 加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84T:，反应时间为30分钟，按微颗粒球 大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在 84'C老化两小时，自然冷却。根据反应加入的有效量与反应总体积计算该反应 的浓度，并根据标准浓度在波长550nm采用比浊法测定OD值换算成平均直径， 亦可用电子显微镜直接测量微球的直径，按此操作合成的微球直径均匀度大于 98%。(2) 抗体、抗原的制备由市购采得，按33°/。 (W/V)硫酸铵饱和沉淀纯比较温和，抗体不易变性。(3) 常温下在前述微颗粒球液中按1%浓度含有效羧基量为0.005mM计加 入水溶碳化二亚胺EDC， ( 0.005*192*40°/。) mg量，在pH<6.5条件下活化20 分钟，将pH上调至7.0-7.2，加入正氨基已酸(0.005*132*60%) mg量，在室温 下作用2小时将pH上调至7.5, 在4。C过夜，次日对0.025M,pH7.0的NaCL 溶液透析两次，备用。在此反应中羧基的活化pH条件必须控制在4.5-6.5之间， 当pH〉6.5时，EDC活化羧基将失败。但是当羧基活化之后，pH>6.5时反应 速度明显减慢但不终止反应。这样操作将使抗体抗原的分布均匀度大大提高， 可使检测的灵敏度提高一个数量级。(4) 将上述已伸手臂的微球液按15。/。r(0.005"92n5。/。)量加入EDC，活化 20分钟后，加入50%体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入 抗体液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0,置于4'C平衡过夜；次 日，将pH调至7.0，再置于4。C平衡过夜；48小时后，按2.0mg/lQ/。'ml的比例 加入牛血清白蛋白(溶于0.025M,NaCL,pH6.8)封闭过夜，最后补加甘氨酸， 乙二醇，NaN3,使其最终浓度达到0.12M,30。/。，0.1。/。,pH7.4;在4。C中储存3日 后待用。为了增加包被抗体的自由度，由于在微球颗粒的表面适当增加一定量 的手臂，以提高抗体在空间的自由度，减少位阻。通过微球表面增加手臂的方 法又可以使反应灵敏度提高一个数量级。(5) 据此制成高灵敏免疫定量胶乳测定试剂。应用例l.以P微球蛋白检测为例，将正常人血清稀释100倍后，在500nm 波长检测的A0DX).1; 5倍稀释人血清后在波长检测的AOD2001.4 。 P微球 蛋白是一个分子量仅11800的小蛋白分子且抗原决簇只有2个。测试条件如下Ri (Tris缓冲液)800ul，其组成(20mMTris三羟甲基氨基甲垸pH 7.4 内含7。/。(w/w)尿素，7。/。(w/w)二甲基甲酰胺，5mMEDTA'2Na乙二胺四乙酸二 钠盐，0.5%。TWeen-20, 3.6%(w/w)聚乙二醇(FW 6000) 0.1% NaN3, 0.12M NaCL);R2 (乳胶抗体液)150 "1,其组成如前述；S(样本)20ul ;入 (波长)500nrn， T° 37°C ;Ri加S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法方法，其特征是：　高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的组成：　Ｒ↓［２］（微球粒浓度为０．２～０．４％（ｗ／ｗ），０．１２Ｍ甘氨酸缓冲液ｐＨ７．２，乙二醇３０％（Ｖ／Ｖ），２ｍＭ　ＥＤＴＡ.２Ｎａ乙二 胺四乙酸二钠盐，０．１％ＮａＮ↓［３］）　其制备经过下列步骤制备：　（１）载体免疫定量胶乳微颗粒的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中绝大部分氧气，经冷却后取７５０ｍｌ加入１．０ｇ十二烷基磺酸钠ＳＤＳ在６５℃恒温１０分钟，待ＳＤＳ呈 悬浮溶液状态后加入含量大于９８％的苯乙烯单体３０ｍｌ，再将温度上调至７５℃，平衡１５分钟后加入丙烯酸５．２ｍｌ（ｐＨ调节至５．５－６．５），平衡后加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至８４℃，反应时间为３０分钟，按微颗粒球大小表面羧基量的４倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在８４℃老化两小时，自然冷却；　（２）抗体、抗原的制备：由市购采得，按３３％（Ｗ／Ｖ）硫酸铵饱和沉淀纯化抗体；　（３）常温下在前述微颗粒球液中按１％浓度含有效羧基量为０．００５ｍＭ计加 入水溶碳化二亚胺ＥＤＣ，（０．００５＊１９２＊４０％）ｍｇ量，在ｐＨ＜６．５条件下活化２０分钟，将ｐＨ上调至７．０－７．２，加入正氨基己酸（０．００５＊１３２＊６０％）ｍｇ量，在室温下作用２小时将ｐＨ上调至７．５，在４℃过夜，次日对０．０２５Ｍ，ｐＨ　７．０的ＮａＣＬ溶液透析两次，备用；　（４）将上述已伸手臂的微球液按１５％ｒ（０．００５＊１９２＊１５％）量加入ＥＤＣ，活化２０分钟后，加入５０％体积的乙二醇，并将ｐＨ上调至７．０－７．２，平衡后快速倒入抗体液，在室温下作 用２小时，同时控制ｐＨ不低于７．０，置于４℃平衡过夜；次日，将ｐＨ调至７．０，再置于４℃平衡过夜；４８小时后，按２．０ｍｇ／１％.ｍｌ的比例加入牛血清白蛋白（溶于０．０２５Ｍ，ＮａＣＬ，ｐＨ　６．８）封闭过夜，最后补加甘氨酸，乙二醇，ＮａＣＬ，使其最终浓度达到０．１２Ｍ，３０％，０．１％，ｐＨ７．４；在４℃中储存３日后待用；　（５）完成制备。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李惠福，
申请(专利权)人：李惠福，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]