本发明专利技术属于血液病辅助诊断试剂领域，具体涉及一种MiR‑17‑5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用，包括MiR‑17‑5p的qPCR上游引物，序列为：5’‑GCCGCCAAAGTGCTTACA‑3’以及MiR‑17‑5p的qPCR下游引物，序列为：5’‑CAGAGCAGGGTCCGAGGTA‑3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3’。本发明专利技术作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR‑17‑5p预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于血液病辅助诊断试剂领域，具体涉及一种MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用。
技术介绍
血液系统肿瘤已成为威胁人类生命的主要疾病之一，恶性血液病是一类难治性血液系统肿瘤，其特点在于治疗棘手，生存期短，预后差，且具体发病机制至今尚未明了。在对恶性血液病的干预治疗中，如果能对疾病做出早期诊断并达到良好的评估，对于改善患者的临床缓解率及预后评估提供有效的帮助，提高生存与治愈率。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约19-24nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因3’UTR区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而调控转录后靶基因的表达。近年来研究发现，miRNAs与血细胞分化调控及血液肿瘤的发生、发展、诊断和治疗等密切相关，这也提示我们从miRNAs入手可能为恶性血液病的诊断和治疗提供新的思路和手段。恶性血液病包括骨髓异常增生综合征(MDS)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)以及再生障碍性贫血(AA)等。MiR-17在基因组水平上定位于人类染色体13q31.3，本研究主要以MDS、AML以及CML为例，阐明MiR-17-5p表达量的检测对于恶性血液病早期诊断的意义。实验中我们发现与正常人样本相比，MiR-17-5p在恶性血液病患者中表达明显上调，提示MiR17-5p可能作为恶性血液病诊疗的有效靶点。目前越来越多的研究表明miRNAs在恶性血液病的风险评估和发病机制中发挥着重要的作用，目前针对恶性血液病的诊断尚无明确的分子标记物。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的之一是提供一种灵敏度强、特异性高、能快速检测MiR-17-5p以预估患者是否有恶性血液疾病的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂。本专利技术的目的之二是提供MiR-17-5p在制备恶性血液病辅助诊断试剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列为：5’-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3’以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。还包括MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。上述逆转录引物是采用CN200610027217.7的专利的原理设计而成的。所述的MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液均为10uM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液等比例(同体积)混合，稀释10倍制成浓度为1uM的逆转录引物混合液。上述贮存液的溶剂为蒸馏水。U6是一类核小分子RNA，U6逆转录引物以这类小分子RNA为模版逆转录后得到cDNA，在qPCR体系中作为内参。值得一提的是，逆转录引物不局限于本专利技术的逆转录引物，任意能扩增出MiR-17-5p或U6的cDNA(后续用于MiR-17-5p或U6的qPCR)的逆转录引物均能实现专利技术目的，该部分引物的设计为现有技术，不再赘述。逆转录反应体系总体积是20ul，具体如下：另：5×反应缓冲液包括250mM Tris-HCl pH 8.3、250mM KCl、20mM MgCl250mTDDT；x为RNA模板的体积。还包括分离单核细胞以及总RNA提取试剂；分离单核细胞所需试剂：淋巴细胞分离液和1640培养基；RNA提取所需试剂：①PBS缓冲液，浓度为0.01M，pH7.4；②氯仿，纯度为99.7％；③异丙醇，纯度为99.7％；④乙醇，浓度为95％，其中含5％的0.1％DEPC溶液；⑤DPEC溶液，DPEC浓度为0.1％。qPCR反应体系如下，每个反应管总体积是20ul：若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物；若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用U6逆转录引物得到的反应产物。本专利技术作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR-17-5p预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。同时拟采用细胞增殖、细胞分化、流式分析、基因芯片、双荧光素报告酶基因等体外研究手段，揭示MiR-17-5p在恶性血液病中发挥的功能和调控机制，以及作为相关辅助诊断的依据。附图说明图1为本专利技术的恶心血液病辅助诊断试剂的使用流程图；图2为MiR-17-5p扩增曲线图；图3为MiR-17-5p溶解曲线图；图4为MDS样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；图5为MDS相对高危组(MDS-RAEB)与低危组(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之间MiR-17-5p的检测对比图；图6为AML样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；图7为恶性血液病(MDS/AML/CML)之间MiR-17-5p的检测对比图。具体实施方式以下将结合附图和实施例详细地说明本专利技术所涉及实施例的技术方案。MiR-17在基因组水平上定位于人类染色体13q31.3，MiR17-5p的具体位置为X染色体:1391350605-1391350688。实验流程根据图1，恶性血液病辅助诊断试剂的使用流程如下：特异的茎环逆转录引物与定量PCR引物的设计及合成；骨髓样品通过Ficoll密度梯度离心法提取单核细胞；单核细胞总RNA的提取；RNA定量及质量检测；使用茎环引物进行逆转录(RNA:500ng/体系)；qRT-PCR检测分析。采用NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度及OD值，OD260/280值在1.8～2.0之间；茎环逆转录引物是一种专门设计的茎环结构引物，“茎”部分的碱基的互补和堆积能增加RNA-DNA杂交复合物的热稳定性，茎环结构的空间约束力相比于传统的线性逆转录引物来说，更有助于提高反应的特异性，MiR17-5p逆转录引物与MiR17-5p 3’端特异性结合后，在逆转录酶作用下进行逆转录反应。一、引物设计和合成实验中所涉及的逆转录引物和qPCR引物均委托苏州吉玛基因公司合成，MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列(均为DNA)如表1：表1 MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列二、分离单核细胞以及总RNA的提取通过Ficoll密度梯度离心法从骨髓样本中分离出单核细胞，并从单核细胞提取总RNA；具体如下：单核细胞分离步骤：①在试管中加入5-6ml淋巴细胞分离液，在上层缓慢地加入骨髓或外周血，使骨髓或外周血与淋巴细胞分离液形成一层清晰的分界，2200rpm/min离心20min；②使用吸管吸取白膜层。加入10ml 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
MiR‑17‑5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR‑17‑5p的qPCR上游引物，序列为：5’‑GCCGCCAAAGTGCTTACA‑3’以及MiR‑17‑5p的qPCR下游引物，序列为：5’‑CAGAGCAGGGTCCGAGGTA‑3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3’。
【技术特征摘要】
1.MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列为：5’-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3’以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。2.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，还包括MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。3.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，所述的MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液均为10uM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液等比例混合，稀释10倍制成浓度为1uM的逆转录引物混合液。4.根据权利要求3所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋耀华，吴德沛，何杨，杨舒婷，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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