一种抗GPC3的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种ＧＰＣ３的单克隆抗体，其由保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３２３２的抗人ＧＰＣ３单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。该单克隆抗体可用于肝细胞癌免疫组化检测。

A monoclonal antibody against GPC3

The invention discloses a monoclonal antibody of GPC3, which is secreted by hybridoma cell lines with an anti human GPC3 monoclonal antibody numbered CGMCC No.3232. The monoclonal antibody can be used for immunohistochemical detection of hepatocellular carcinoma.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
具体地说，本专利技术涉及一种抗磷脂酰肌醇聚糖蛋白3 (GPC3)的单克隆抗体、以及一种用于肝细胞癌免疫组化检测的试剂盒。
技术介绍
原发性肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，目前在世界范围内其发病率呈上升趋势。 近几年全球肝癌每年新发病例50-60万，其中50%左右发生在我国。由于其发病较隐匿，临 床症状不典型，难以早期诊断，大部分肝癌发现时已是中晚期，不仅错过了治疗的最佳时期， 更由于缺乏特异的治疗方式以及高复发性，其预后不佳。目前，肝癌在我国居恶性肿瘤死亡 率的第二位。目前，图像诊断、病理诊断及化学诊断是肿瘤诊断的三大支柱。肝癌的病理学诊断是为 临床医师了解肝病的病因、发生机制、肝脏病理变化、类型、患者临床治疗方案和实用研究 的基础。肝原发性肿瘤的组织来源复杂，各种良性、恶性肿瘤超过100种，病理诊断和鉴别 诊断存在一定的困难。肝细胞癌(HCC)与肝内胆管癌(ICC)及转移性腺癌(MAC)的鉴 别诊断是外科病理诊断中常遇到的难题，尽管大多数病例可通过临床特点、常规HE染色做 出正确诊断，但免疫组化在临床症状不典型和病理学不确定时具有非常重要的价值。免疫组织化学(Immuno-histochemistry，免疫组化)技术是肝脏病理诊断中不可缺少的、 最重要的辅助手段。然而免疫组化实验中可供选择的肝细胞特异性抗体种类极少。目前临床 病理广泛使用的肝细胞癌诊断标志物主要是HepPar-l、 CD34、 pCEA、 AFP等，但其特异性 和敏感性存在有一定的局限性，给肝癌的病理诊断和鉴别诊断带来极大不便[Wee A..Appl Immunohistochem Mol Morphol.2006;14:266~272]。因此需要新的肿瘤标志物，建立多指标联 合检测体系，弥补单一指标的不足。磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)基因定位于人染色体Xq26，其cDNA序列全长为2263 bp， 由8个外显子组成，编码由580个氨基酸组成的硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖。GPC3的分子量 为60-70 kDa，通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol， GPI)锚连接于细胞膜， 属于蛋白聚糖家族。已有的实验研究表明，GPC3 mRNA和GPC3蛋白在肝癌中特异性高表达，与肝癌的发生发展有十分密切关系[Zhu ZW, Friess H, Wang L, Abou-Shady M, Zi腿ermann A, Lander AD: Korc M， Kleeff J, Btichler MW. Gut 2001; 48:558- 64]。已有的研究与文献报道均表明，GPC3 与肝癌的发生发展有密切关系，不仅在肝癌的早期有较高的检出率，而且随着肝癌的进展， 其检出率也随之增高。通过对肝癌病人进行研究，我们检测到76.7% (23/30)肝癌组织内有 GPC3表达，其中13.3 % (4/30)癌旁组织有GPC3弱阳性表达；而另外7例肝癌组织内GPC3 表达阴性的病人，其癌旁组织GPC3也表达阴性。重要的是，在血清AFP阳性病人的肝癌组 织中有88 。/。表达GPC3 mRNA，而在血清AFP阴性的病人肝癌中仍可发现有73 %呈GPC3 mRNA表达阳性。在直径〈3cm肝癌中，GPC3 mRNA阳性表达率为77 %，这显著高于血清 AFP水平升高率43 %和肝癌中AFP mRNA表达率41 %[周学平，王红阳，中华外科杂志，1999; 37 (3) : 171-173]。在肝腺瘤、胆管细胞癌、肝转移癌和12种常见实体瘤以及21个非肝癌 细胞系中，均未检测到GPC3表达，表明GPC3是一个肝癌内特异表达的基因，在AFP阴性 的肝癌患者中有较高的检出率。因此，GPC3是一个新的肝癌标志物，很有潜力用于肝癌的 检测。
技术实现思路
基于上述发现，本专利技术的首要目的在于提供一种可用于肝细胞癌免疫组化检测的抗GPC3 的单克隆抗体。本专利技术的另一目的在于提供一种用于肝细胞癌免疫组化检测的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术手段一种抗GPC3的单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCC No. 3232的抗人GPC3单克隆抗 体杂交瘤细胞株分泌产生。上述单克隆抗体是按照以下步骤制备的在小鼠体内接种杂交瘤细胞CGMCCNo. 3232， 生产腹水抗体，取出腹水进行纯化，得到抗GPC3的单抗；或者体外培养杂交瘤细胞CGMCC No. 3232，分离纯化培养液，获得抗GPC3的单克隆抗体。一种用于实施上述应用的试剂盒，其包含(1) 上述抗GPC3的单克隆抗体；以及(2) 当GPC3结合于所述单克隆抗体时，能够结合于GPC3的标记抗体。 研究表明，本专利技术的单克隆抗体是IgG型的免疫球蛋白，可特异性地结合于GPC3蛋白，因此其可用于肝细胞癌免疫组化检测，可以有效提高肝癌诊断的灵敏度、特异性和准确率， 并且可以推广至肝癌的预后评估、治疗效果评估及病程监测。附图说明图1是大肠杆菌XL1 Blue表达的GPC3融合蛋白的SAS-PAGE电泳照片。其中左侧和中 间条带为纯化后的GPC3融合蛋白；右侧条带(M)为分子量标准物Marker。图2是单克隆抗体Ig类与亚类的鉴定结果。我们通过体外细胞培养的方法获得大量的杂 交瘤细胞上清，采用小鼠单克隆抗体Ig类与亚类检测试剂盒(HyCult biotechnology bv Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit, P/N: HL2010)进行Ig类与亚类鉴定。结果表明(见图2)， 6种单克隆抗体Z1C15重链均为IgG2b型，轻链均为k链。图3是293T细胞瞬时转染GPC3及空载体质粒48 h后进行Western Blot实验的检测照片。 左侧为GPC3蛋白(293T细胞瞬时转染GPC3质粒裂解液)，右侧为空白对照(293T细胞瞬 时转染空载体pcDNA3.1A质粒裂解液)。实验条件为变性样品进行SDS-PAGE蛋白电泳； 通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicher and Schcell公司)；5 %脱脂奶粉封闭1 h， TBST洗三次，每次5min; 5 % BSA稀释抗GPC3单克隆抗体Z1C15—抗，孵育2 h， TBST 洗三次，每次5min; 5%脱脂奶粉稀释羊抗小鼠二抗(华舜公司)，孵育1 h， TBST洗三次， 每次5-10min;化学发光法(ECL)显影。图4是对Huh7、 PLC、 SMMC7721、 Hep3B、 L02和Hela细胞裂解液进行Western Blot 实验的检测照片。实验条件为变性样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；通过电转仪将蛋白转移 至硝酸纤维素膜(Schleicher and Schcell公司)；5 %脱脂奶粉封闭1 h， TBST洗三次，每次5 min; 5。/。BSA稀释抗GPC3单克隆抗体Z1C15—抗，孵育2 h， TBST洗三次，每次5 min; 5%脱脂奶粉稀释羊抗小鼠二抗(华舜公司)，孵育lh， TBST洗三次，每次5-10min;化学 发光法(ECL)显影。微生物保藏说明保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC); 保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＧＰＣ３的单克隆抗体，其由保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３２３２的抗人ＧＰＣ３单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。

【技术特征摘要】
1.一种抗GPC3的单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCC No.3232的抗人GPC3单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。2. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其按照以下步骤制备在小鼠体内接种杂交瘤细胞CGMCC No. 3232，生产腹水抗体，取出腹水进行纯化，得 到抗GPC3的单抗；或者体外培养杂交瘤细胞CGMCCNo.3232，分离纯化培养液，获得抗GPC3的单克隆抗体。3. 如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，周赟，谈治雄，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]