甲型流感病毒、Ｈ１Ｎ１及Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉的甲型流感病毒、Ｈ１Ｎ１及Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明专利技术根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中公布的Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ?Ａ?Ｖｉｒｕｓｅ（Ｈ１Ｎ１）ｖｉｒｕｓ?２００９年北美变异株Ｍ基因、ＨＡ基因序列和Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ?Ａ?Ｖｉｒｕｓｅ（Ｈ３Ｎ２）流行株的ＨＡ基因序列，通过序列比对寻找高度保守的区域，设计特异性引物和ＴａｑＭａｎ探针，研制检测方法中的关键试剂——探针、引物和阳性对照（构建甲型流感病毒及Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒基因重组克隆质粒），经各反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验，建立了甲型流感病毒及Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，一次试验即可同时特异性地检测甲型流感病毒、Ｈ１Ｎ１亚型流感病毒和Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒。

Influenza A virus, H1N1 and H3N2 subtype influenza virus detection method and detection kit

The invention discloses a method for detecting influenza A virus, H1N1 and H3N2 subtype influenza virus, which is specific, sensitive, reproducible, fast and low in cost, and a kit for detecting influenza viruses. According to the invention published in the GeneBank Influenza? A? Viruse (H1N1) virus? 2009 North America mutation of M gene and HA gene sequences and Influenza? A? Viruse (H3N2) HA gene sequences of strains, by sequence alignment for highly conserved regions, the design of primers and TaqMan probe, probe, key positive control primers and reagent in the detection method (recombinant influenza virus and H1N1 and H3N2 subtypes of influenza virus gene cloning plasmid), through the optimization of reaction conditions and the specificity, sensitivity and repeatability, established the influenza A virus and H1N1 and H3N2 subtypes of influenza virus by real-time fluorescent RT - PC R detection method, a test can be specific detection of influenza A virus, H1N1 subtype influenza virus and H3N2 subtype influenza virus.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂品.ο
技术介绍
流行性感冒(influenza)简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，此病传染性强，传播迅速，抗原易变异，尤其是甲型流感病毒，其进化频率高于乙型和丙型流 感病毒，曾经三次导致世界性流感病毒大流行，如1918年的Hmi (猪型)，1957年的H2N2 型(亚洲型)和1968年的H3N2型(香港型)。目前，墨西哥、美国爆发的甲型流感病例属 于Hmi亚型，引起这次疫情的Hmi亚型流感病毒为流感病毒新变异型一2009年北美变异 株，可同时感染人和猪。在自然界中，甲型流感病毒的宿主范围相当广，猪、马、水貂、海豹、鲸、禽类以及人 类中都已经分离出甲型流感病毒。但是甲型流感病毒在不同宿主中的亚型分布不同，所有 的HA、NA亚型均能从禽类中找到，水禽是其天然储存库；而在哺乳动物中仅发现了有限的 亚型，已知的只有三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(附和N2)，其中Hmi和H3N2 型是感染人类并能够引起一定范围流行的甲型流感病毒。研究发现猪在流感传播过程中承担了流感病毒基因重组发生混合器的角色，同时 猪也能感染禽流感和人流感。禽Hmi和人H3N2可传播给猪，猪Hmi可传播给人，人流感 病毒可传播给鸭，并在鸭体内储存。1918年引起世界性流行的猪型流感病毒Hmi就可能来 自禽流感病毒；实验感染也发现，禽、人流感病毒在猪体内都可有效繁殖，种系及流行病学 分析也表明，禽、人流感病毒可通过自然途径传播给猪，并在猪体内重组后传播给人。最早报导的从猪体内分离出类似甲/Hong Kong/68的流感病毒是在1969年，而后 在世界各地连续不断地从猪群中分离到H3N2病毒株。一些间接的血清学证据也表明，人类 H3N2型流感病毒的变异株可以感染猪。1976年1月，在美国新泽西州发生了甲1型(猪 型)流感。从1名死于肺炎的士兵体内分离到此型病毒。通过流行病学调查，多数患者与 猪有密切的接触史。综上所述，甲型流感病毒Hmi亚型2009年北美变异株、类人型Hmi和古典型猪 HlNl、H3N2均应是我国口岸检验检疫关注的重点检疫目标，在高度重视Hmi亚型2009年 北美变异株的同时，也要注重类人型Hmi和古典型猪H1N1、H3N2的防控工作。为更好、更 彻底地从根本上防控甲型流感疫情，严格出入境检验检疫，防范甲型流感跨境传播，确保人 民群众身体健康和生命安全，很有必要迅速建立起特异性强、敏感性高、适合国境口岸快速 验放的甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒的快速检测方法。实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)将普通RT-PCR技术与荧光检测相结 合，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整 理，结果更为准确直观，整个检测过程只打开一次试管，有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。 文献检索表明，目前国内外诊断甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒的方法 仍然是病毒分离、血清学诊断反应和普通RT-PCR、荧光RT-PCR等，一次试验完成甲型流感 病毒初筛及HlNl、H3N2亚型流感初步确认的荧光RT-PCR检测技术尚属空白。经典的病毒 分离、血清学诊断方法费时费力，不适于临床检测，不符合生物安全条例的要求，无法满足 国境口岸快速验放的要求。普通PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测扩增反应 后需要电泳检测，这不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。单重 荧光RT-PCR，仅能对流感进行通用型检测，不能确诊定型。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒、 HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本专利技术采用的荧光定量RT-PCR方法 具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点，一次试验即可完成甲型流感病毒初筛和 HlNU H3N2亚型流感病毒初步确认。本专利技术所采用的技术方案是本专利技术中甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒 检测方法，包括以下步骤(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感病毒、HlNl和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针，具体的核苷酸序列如下A 型流感病毒Pl 5，-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3，P2 5’ -GCTGCAGTCCTCGCTCACT-3’Probe Fam_5， -TGTGTTCACGCTCACCGTGCC-3， -EclipseA型流感病毒Hmi亚型Pl 5’ -CCCCATTGCATTTGGGTAAA-3‘P2 5’ -TGGAGAGTGATTCACACTCTGGAT-3‘Probe Hex_5，-TAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA-3，-Eclipse A型流感病毒H3N2亚型Pl 5， -CTGGATCCTGTGGATTTCCTTT-3，P2 5， -TGATGAACCCCAGCAAAACA-3，Probe Rox_5， -CATATCATGCTTTTTGCTTTGTG-3， -Eclipse ；(2)取被检样品提取病毒RNA ；(3)建立荧光RT-PCR反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光PCR仪 中，加入被检样品提取的RNA模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光PCR仪内一次 完成；(4)结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT 值判定结果。在上述RT-PCR反应体系设立有阳性对照和阴性对照进行反转录和扩增。所述阳性对照是采用甲型流感病毒及Hmi和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质 粒，所述阴性对照是采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF胚的尿囊液。上述步骤⑵中荧光RT-PCR反应参数如下_反应温度 反应时间 循环次数荧光收集150°C30min 1不收集294 °C3min1不收集94°C10 s不收集345 0C30 s3不收集 72 C 60s 不收集94 10 s不收集44555 °C35 s收集本专利技术还提供一种用于甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法的试 剂盒，荧光RT-PCR反应液组份及浓度为终浓度1 xRT-PCR缓冲液10 mmol/L Tris-Cl，50 mmol/LKCl, pH8.3~dNTP0.1 0.8 mmol/LMgCl2卜 8 mmol/LDTT2 mmol/L甘油5%Taq酶0.5 3.5 UAMV反转录酶50 300 U各引物 Pl0.1 1 μιηοΙ/L各引物 P20.1 — 1 μπιοΙ/L各探针 Probe0.1-1 μιηοΙ/L上述荧光RT-PCR反应液的优选浓度如下<table>table see original document page 8</column></row><table>所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。本专利技术的有益效果是本专利技术针对甲型流感病毒Hmi亚型2009年北美变异株，建 立可检测Hmi亚型2009年北美变异株、类人型Hmi和古典型猪H1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲型流感病毒、Ｈ１Ｎ１及Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：　　（１）选取适当的Ｍ基因、ＨＡ基因相关序列，设计特异性检测Ａ型流感病毒、Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的特异性引物及Ｔａｇｍａｎ荧光探针，具体的核苷酸序列如下：　　Ａ型流感病毒：Ｐ１　５’－ＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＡＧＧＡＴ－３’　　Ｐ２　　５’－ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴ－３’　　Ｐｒｏｂｅ　Ｆａｍ－５’－ＴＣＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣ－３’－Ｅｃｌｉｐｓｅ　　Ａ型流感病毒Ｈ１Ｎ１亚型：　　Ｐ１５’－ＣＣＣＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＡ－３’　　Ｐ２５’－ＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＴ－３’　　Ｐｒｏｂｅ　Ｈｅｘ－５’－ＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＡ－３’－Ｅｃｌｉｐｓｅ　　Ａ型流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型：　　Ｐ１５’－ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴ－３’　　Ｐ２５’－ＴＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡ－３’　　Ｐｒｏｂｅ　Ｒｏｘ－５’－ＣＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧ－３’－Ｅｃｌｉｐｓｅ；　　（２）取被检样品提取病毒ＲＮＡ；　　（３）建立荧光ＲＴ－ＰＣＲ反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光ＰＣＲ仪中，加入被检样品提取的ＲＮＡ模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光ＰＣＲ仪内一次完成；　　（４）结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和ＣＴ值判定结果。...

【技术特征摘要】
一种甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针，具体的核苷酸序列如下A型流感病毒P1 5’-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3’ P2 5’-GCTGCAGTCCTCGCTCACT-3’ Probe Fam-5’-TCTGTTCACGCTCACCGTGCC-3’-EclipseA型流感病毒H1N1亚型 P15’-CCCCATTGCATTTGGGTAAA-3’ P25’-TGGAGAGTGATTCACACTCTGGAT-3’ Probe Hex-5’-TAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA-3’-EclipseA型流感病毒H3N2亚型 P15’-CTGGATCCTGTGGATTTCCTTT-3’ P25’-TGATGAACCCCAGCAAAACA-3’ Probe Rox-5’-CATATCATGCTTTTTGCTTTGTG-3’-Eclipse；(2)取被检样品提取病毒RNA；(3)建立荧光RT-PCR反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光PCR仪中，加入被检样品提取的RNA模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光PCR仪内一次完成；(4)结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒、H...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，陈博文，沙才华，廖明，徐海聂，廖秀云，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]