本发明专利技术涉及一种甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＮＡ检测试剂盒，根据荧光ＰＣＲ技术原理，设计甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒的特异引物和ＴａｑＭａｎ探针，通过全自动荧光定量ＰＣＲ检测仪进行检测，从而实现对甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＮＡ的定性检测。试剂盒以人上皮细胞中核糖核酸酶Ｐ（ＲＮａｓｅ Ｐ）基因为内标，对提取过程进行监控。本发明专利技术试剂盒检测样本为鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种流感病毒RNA检测试剂盒，特别涉及甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒。
技术介绍
流感病毒共有三个型别，即甲(A)、乙(B)和丙(C)型流感病毒。甲型流感病毒感染哺乳动物(人类、猪、雪貂、马)以及鸟类。乙型流感病毒只感染人类。它表面突起的只有一种蛋白质，较为简单。但蛋白质的顺序会有不同。乙型病毒爆发时也会引起地区流行，但是疾病的产生通常较甲型病毒温和。丙型流感病毒只感染人类，并不会引起严重的疾病。 甲型流感病毒是一种分节段RNA病毒，共含有7条结构蛋白基因和1条非结构蛋白基因(NS)，结构蛋白分别为核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、HA、NA、PA、PB1和PB2，其中前4种蛋白为病毒粒体的组成成分，后三种蛋白均为功能性多聚酶，参与病毒基因的转录和复制，在病毒粒体中属于分子量最大但含量极少的蛋白。根据美国疾病预防控制中心和世界卫生组织公布的甲型H1N1流感病毒的基因组成信息，研究人员将甲型H1N1流感病毒的基因与之前医学界已经掌握的部分猪流感病毒的基因进行了对比，利用流感病毒信息库和快速分析平台，对已报道的22株在病毒序列进行分析，各地分离株的核苷酸序列的同源性达到99％以上，属于同一株病毒。对HA基因和NA基因进行分析，确认引起本次疫情的病原体属于A/H1N1亚型流感病毒。同时对整个病毒的8条基因进行进一步分析，发现此次流行的病毒株包含一种较为独特的基因片段组合，是来自北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体。 本次流行的流感毒株的HA基因核苷酸序列与早期从美国分离到的H1N2的猪流感病毒株的同源性达到93％以上，其中与印第安纳州的H1亚型猪流感病毒(A/Swine/Indiana/P12439/00(H1N2))具有95％的同源性。提示本次A/H1N1流感病毒的HA基因由北中美洲本地的猪流感病毒变异而来。 NA基因没有发生核苷酸缺失，其序列具有欧亚株系猪流感病毒的特征，同源性在90％以上的病毒都是来源于欧亚地区的H1N1猪流感病毒，其中与A/Swine/England/195852/92(H1N1)，A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1)的核苷酸同源性达到了94％。M基因的核苷酸序列也与欧亚株系的猪流感病毒的同源性最高，达到96％。提示NA和M基因来源于欧亚株系的猪流感病毒。 PB1、PB2、NP、NS基因的核苷酸序列与美韩等国分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96％；PA基因的核苷酸序列与美国本土分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96％。其中PB2和PA基因与2007年部分从南达科他州分离到的H3N2禽流感病毒的同源性也有96％。 这种来自北中美和欧亚两种猪流感病毒的混合体是一种新型的A/H1N1病毒，以前从未发现这种重组病毒在猪群中感染和流行，也从未在美国以及其它国家的猪流感和人流感病毒分离株中出现，人类从未感染过此类病毒，机体对该病毒缺乏免疫保护能力，从而显示出其较强的致病能力。 荧光PCR法即实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 TaqMan荧光探针的工作原理为PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 RT-PCR能准确检测到新甲型H1N1流感病毒多个特异性基因，区分出季节性H1N1流感病毒，适用于普通医务和检验检疫人员使用；多重RT-PCR检测试剂盒，能够多点、全面检测到新甲型H1N1流感病毒的多个特异基因，适用于流感监测机构和医院；实时RT-PCR检测试剂盒，能够对检测到的基因片段直接进行序列测定，在最短时间内得出准确结果。 本专利技术通过甲型H1N1流感病毒RNA的检测，以辅助判定流感样症状病例是否感染甲型H1N1流感病毒。
技术实现思路
本专利技术提供一种甲型H1N1流感病毒RNA的检测试剂盒。 本专利技术的试剂盒，包括8种试剂，这8种试剂如下 H1N1反应液FluA，H1N1反应液SWH1，H1N1反应液SWFluA1，内标反应液RNP，DNA聚合酶，逆转录酶，H1N1阳性对照试剂，H1N1阴性对照试剂。本专利技术的试剂盒，8种试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。 本专利技术的试剂盒，优选的组成如下 H1N1反应液FluA1.0ml/管 H1N1反应液SWH11.0ml/管 H1N1反应液SWFluA 11.0ml/管 内标反应液RNP 1.0ml/管 DNA聚合酶 200μl/管 逆转录酶 68μl/管 H1N1阳性对照 100μl/管 H1N1阴性对照 1.0ml/管 其中4种反应液优选的组成如下 (1)H1N1反应液(FluA) (2)H1N1反应液(SWH1) (3)H1N1反应液(SWFluA1) (4)内标反应液(RNP) 本专利技术的试剂盒，4种反应液中涉及的引物和探针的核苷酸序列如下 本专利技术的试剂盒，各试剂配制方法如下 1.H1N1反应液(FluA)的制备 1.1引物和探针代码和核苷酸序列 1.2根据已知的FluA样本的DNA序列，采用现有常规技术制备FluA引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。 1.3按照如下比例配制H1N1反应液(FluA)。 1.4将配置好的H1N1反应液(FluA)按照每管1ml进行分装。 2.H1N1反应液(SWH1)的制备 2.1引物和探针代码和核苷酸序列 2.2根据已知的SWH1样本的DNA序列，采用现有常规技术制备SWH1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。 2.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWH1)。 2.4将配置好的H1N1反应液(SWH1)按照每管1ml进行分装。 3.H1N1反应液(SWFluA1)的制备 3.1引物和探针代码和核苷酸序列 3.2根据已知的SWFluA1样本的DNA序列，采用现有常规技术制备SWFluA1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。 3.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWFluA1)。 3.4将配置好的H1N1反应液(SWFluA1)按照每管1ml进行分装。 4.内标反应液(RNP)的制备 4.1引物和探针代码和核苷酸序列 4.2根据已知的RNP样本的DNA序列，采用现有常规技术制备RNP引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。 4.3按照如下比例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＮＡ检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成如下： Ｈ１Ｎ１反应液（ＦｌｕＡ） １．０ｍｌ／管 Ｈ１Ｎ１反应液（ＳＷＨ１） １．０ｍｌ／管 Ｈ１Ｎ１反应液（ＳＷＦｌｕＡ１） １．０ｍｌ／管 内标反应液（ ＲＮＰ） １．０ｍｌ／管 ＤＮＡ聚合酶 ２００μｌ／管 逆转录酶 ６８μｌ／管 Ｈ１Ｎ１阳性对照 １００μｌ／管 Ｈ１Ｎ１阴性对照 １．０ｍｌ／管。
【技术特征摘要】
1、一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成如下H1N1反应液(FluA)1.0ml/管H1N1反应液(SWH1)1.0ml/管H1N1反应液(SWFluA1) 1.0ml/管内标反应液(RNP) 1.0ml/管DNA聚合酶 200μl/管逆转录酶68μl/管H1N1阳性对照100μl/管H1N1阴性对照1.0ml/管。2、权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含4种反应液，每种反应液的组分及组成比例为(1)H1N1反应液(FluA)(2)H1N1反应液(SWH1)(3)H1N1反应液(SWFluA1)(4)内标反应液(RNP)3、权利要求1的试剂盒，其特征在于，4种反应液含有3个检测引物和探针，1个内标检测引物和探针，引物和探针的代码和核苷酸序列为4、权利要求1的试剂盒，其特征在于，通过设计甲型H1N1流感病毒特异性Taqman探针及配套引物组成的荧光PCR反应系统，实现对甲型H1N1流感病毒的检测。5、权利要求1的试剂盒，其特征在于，试剂盒以人上皮细胞中核糖核酸酶P(RNase P)基因为内标，对提取过程进行监控。6、权利要求1的试剂盒，其特征在于，检测样本为鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液，并进行核酸提取。病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等微量病毒RNA提取试剂盒。7、权利要求1的试剂盒，其特征在于，检验过程中荧光PCR扩增程序为(1)逆转录及变性50℃30分钟，95℃3分钟；(2)预扩增95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，共5个循环；(3)扩增及荧光收集95℃10秒，55℃40秒，共...
【专利技术属性】
技术研发人员：王大燕，高荣宝，温乐英，舒跃龙，李德新，董小平，闫宝山，曹健荣，张誌，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京金豪制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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