以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物领域一种基因重组技术，旨在提供一种成本低，技术简单，操作周期短的定向基因重组试剂盒。试剂盒由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定用引物构成中一种或者若干种构成。在传统的非定向基因重组技术基础上，定向重组载体和错误连接的目的基因之间形成的筛选用酶切位点。利用限制性核酸内切酶对错误连接形成的筛选用酶切位点进行处理，使反向连接的目的基因难以进入细胞克隆扩增。之后利用鉴定引物和原扩增引物的组合对重组产物进行ＰＣＲ鉴定确认目的基因连入载体并连接正确。本发明专利技术适用于常规基因表达尤其是大规模的基因表达操作。

Directed gene recombination kit based on post docking screening

The invention relates to a gene recombination technique in biological field, in order to provide a directed gene recombination kit with low cost, simple technique and short operation cycle. The kit consists of a directed recombinant vector, a directed amplification system, a directionally coupled complex, and an identified primer comprising one or more of the compositions. On the basis of the conventional non directional gene recombination technique, the endonuclease sites formed between the targeted recombinant vectors and the target genes that are connected by error are selected. Using restriction endonucleases, the screening of erroneous connections was processed by enzyme cutting sites, which made it difficult for the target genes in reverse connection to be amplified by cell cloning. After that, the recombinant products were identified by PCR with the combination of the primers and the original amplification primers. The target gene was connected into the vector and correctly connected. The present invention is suitable for routine gene expression, especially large-scale gene expression manipulation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是生物
的一种新型定向基因重组试剂盒。目的基因首先以非定向方式与 相应重组载体连接，之后对错误连接形成的特定选择位点进行连接后处理，使错误连接的目 的基因难以进入宿主细胞或者进入宿主细胞后难以复制，重组产物可通过PCR对产物是否连 入载体，连接方向是否正确进行鉴定。本方法可用于实验室小规模的普通科学研究，更适合 于批量蛋白质的生产或筛选，尤其在生物信息学研究中具有很高的应用价值。
技术介绍
自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术已经形成了一套完善 的体系，其中主要包括目的基因的分离，目的基因和重组载体的限制性切割，目的基因与重 组载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和 反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定 向连接是传统重组技术的核心。目的基因和载体的切割和连接是基因重组过程中操作最为繁琐，工作周期最长，并且失 败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产 品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等， 但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的1、 模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的 In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统，R A.斯图尔特等 的专利技术一一应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(专利申请号00812739. 5)等。 自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混 合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。但是，自然重组技术需要载体末端和目的基因 末端之间存在20 40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，极大的提高了基因重组的操作成本。 而且同源重组是一个动态的双向过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在国内普通实验 室常规使用。2、 以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上 建立的的USER Friendly系统等，以及马立新等申请的尚未明确连接方式的两项专利技术一 一一种零背景高通量定向表达克隆的方法(专利申请号01133158.1)和一种高通量直接定向 克隆构建重组腺病毒的方法(专利申请号200410060972. 6)等。体内连接一般需要目的基因 和载体之间具有4 12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间 建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，工作成本较高； 后者利用了一种常规的工具酶，对引物序列的要求相对较低，不过该专利技术专利尚未声明采用 体内连接技术。上述体内重组技术要求载体必须具备一段游离单链序列，在反复冻溶过程中冻溶过程中这些游离序列很容易出现碱基脱落，影响连接效率，不适合长期应用，难以工业 化生产。上述技术分别从不同的角度发展了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过 高或者连接效率过低等因素的影响，并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。以往在目的基因的克隆扩增阶段，对目的基因进入载体的方向没有特定的要求，可以通 过非定向重组的方式连入载体。比如以Taq酶为基础的扩增产物可以直接连接进入TA克隆载 体，目前很对生物公司也推出了相关的重组试剂盒。另外用其他耐热DNA聚合酶扩增得到的 平滑末端扩增产物，同样可以直接连接到平末端载体中，不需要互补序列。随着连接技术的 进歩，TA克隆和平末端连接克服了连接困难的问题，NEB和Takara等生物公司推出的连接试 剂盒在5 10分钟即可完成操作，目前上述技术已经在大部分实验室应用。本专利技术在传统非定向重组的基础上引入连接后筛选过程，通过限制性内切酶对反向连接 产物形成的特异性选择位点进行加工，使反向连接的重组产物丧失进入宿主细胞或者进入细 胞后难以克隆扩增的能力，从而达到定向连接的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的定向基因重组技术，使人们在不改变既往工作习惯的基础 上，能够给通过简单的方式完成基因重组操作，并降低工作成本，縮短工作周期，提高基因 重组的工作效率。本专利技术的实现过程如下主要是构建一个定向克隆载体和定向目的基因。其中定向重组 克隆载体经过处理后形成可供PCR产物连接所用的平滑末端载体。定向目的基因扩增完成后 形成两个含有不同基因序列的连接点，目的基因和重组载体连接后，在反向连接的连接点处 形成筛选用限制性内切酶酶切位点，而正向连接的产物不能形成相同的的酶切位点。连接完 成后，利用相应的限制性内切酶进行切割，错误连接的载体难以进入细胞或者进入细胞后难 以进行克隆扩增；而正确连接的载体不会被切割从而进行正常克隆扩增。之后产物可通过与 载体同源的鉴定引物和原目的基因同源的扩增引物组合，对重组产物进行PCR鉴定，从而得 到正确的定向克隆。具体实施方式1、定向重组载体定向重组载体可以但不限于来自质粒、粘粒、噬菌体或者病毒载体。载体处理完成后形 成的两个连接点末端存在一个或者多个碱基序列不同，首选5'末端一个但不限于一个碱基 序列不同。制备方式如下1、以两种但不限于两种限制性内切酶对载体进行切割制作连接位点，限制性内切酶可 以选用平滑末端限制性内切酶或者黏性末端限制性内切酶，优选选但不限于平滑末端限制性内切酶，优选但不限于处理后连接点5'末端分别为G和C的限制性内切酶。载体酶切产生 的上下游两个末端分别标记为连接点A和连接点B。2) 对黏性末端载体进行处理，去除或者补平连接位点末端的单链结构，首选但不限于去 除的处理方式。3) 对载体进行或者不进行末端修饰，首选但不限于脱磷酸化处理2、 定向扩增体系的构建定向扩增体系由耐热DNA聚合酶，dNTP，反应缓冲液和无菌去离子水混合构成即用型扩 增体系，冷冻保存，保存时首选但不限于采用速冻的方式；用时加入浓度为50至lJ100倍终浓 度的模板和定向扩增引物进行PCR扩增构成定向扩增体系。耐热DNA聚合酶选择扩增产物为 平滑末端的耐热DNA聚合酶，首选但不限于pfuDNA聚合酶。定向扩增引物中一个或者两个全 部含有不完整的酶切位点所对应的序列；利用该引物获得的目的基因，上下游两个末端分别 标记为连接点a和连接点b。目的基因和相应载体连接时，A和a连接，B和b连接为正确连 接；A和b连接，B和a连接为错误连接。连接点a和连接点b中有一个或者两个全部含有不 完整的酶切位点，与上述定向重组载体错误连接时，A-b连接点或者B—a连接点中有一个或 者两个全部形成完整的筛选用酶切位点，能够被相应限制性内切酶所切割；正确连接时A-a 连接点和B-b连接点两个都不形成相应的筛选用酶切位点；目的基因本身也不含有相应的酶 切位点。3、 定向连接复合物的构建定向连接复合物由DNA连接酶和限制性内切酶构成，DNA连接酶首选但不限于T4DNA连 接酶，限制性内切酶首选但不限于酶切产物为平滑末端的限制性内切酶。第一种方式连接反应和切割反应依次独立进行。定向连接复合物由DNA连接酶，限制性内切酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及生物技术领域中一种以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒，由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定引物中一种或者若干种构成；其特征在于，目的基因经过定向扩增以后和定向重组载体非定向连接，由限制性内切酶对错误连接产物在连接点处形成的酶切位点进行切割，使其难以进入宿主细胞或者进入细胞后难以复制，而正确连接的产物则不受其影响；最后通过鉴定引物和原扩增用引物联合对目的基因连接的状态进行鉴定。

【技术特征摘要】
1、本发明涉及生物技术领域中一种以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒，由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定引物中一种或者若干种构成；其特征在于，目的基因经过定向扩增以后和定向重组载体非定向连接，由限制性内切酶对错误连接产物在连接点处形成的酶切位点进行切割，使其难以进入宿主细胞或者进入细胞后难以复制，而正确连接的产物则不受其影响；最后通过鉴定引物和原扩增用引物联合对目的基因连接的状态进行鉴定。2、 根据权利要求l所述的定向基因重组试剂盒，其特征是定向重组载体末端含有两个 可以与目的基因连接的连接点A和B，连接点A和连接点B的碱基序列不同，优选但不限于 单碱基G和单碱基C的组合，既连接点A的5'末端为G，连接点B的5'末端为C;或者连 接点A的5'末端为C，连接点B的5'末端为G。3、 根据权力要求l所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是定向扩增体系由扩增体系、 定向引物和模板构成；扩增体系是产物为平滑末端的耐热DNA聚合酶，dNTP,反应缓冲液混合 组成的即用型混合物，用时加入定向引物和模板；定向引物由上游引物和下游引物构成，试 剂盒提供合成方案；利用定向引物扩增完成后，目的基因两端为与相应载体连接所用的连接 点a和b,其中连接点a和连接点b中有一个或者两个全部含有不完整的限制性内切酶酶切位4、根据权力要求l所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是权力要求2或权力要求3 中所描述的定向目的基因和定向...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永钢，
申请(专利权)人：张永钢，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]