LSECtin的一种新用途制造技术

本发明专利技术公开了ＬＳＥＣｔｉｎ在制备治疗和／或预防自身免疫性肝炎药物中的应用。针对Ｔ细胞功能调节的免疫治疗已成功应用于多种自身免疫性疾病、移植排斥反应以及慢性病毒感染中，本发明专利技术通过实验证明：ＬＳＥＣｔｉｎ表达在肝脏的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞和窦内皮细胞；能粘附活化的外周血Ｔ细胞；在活化Ｔ细胞上的配体分子为ＣＤ４４；ＬＳＥＣｔｉｎ的ＣＲＤ结构域和ＣＤ４４分子的Ｎ糖基化参与了ＬＳＥＣｔｉｎ和ＣＤ４４分子对之间的相互识别；ＬＳＥＣｔｉｎ做为一种Ｔ细胞的负调控分子参与抑制免疫反应；敲低ＬＳＥＣｔｉｎ表达加重模型小鼠肝炎症状；外源注射ＬＳＥＣｔｉｎ重组蛋白或质粒能缓解肝炎症状。说明ＬＳＥＣｔｉｎ可用于制备治疗和／或预防自身免疫性肝炎的药物。

A new use of LSECtin

The present invention discloses the use of LSECtin in the preparation, treatment and / or prevention of autoimmune hepatitis. For the treatment of T cell immune function regulation has been successfully applied to a variety of autoimmune diseases, transplantation rejection and chronic viral infection, the invention is proved by experiments: the expression of LSECtin in Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells; peripheral blood T cell adhesion to activated; in the activation of ligand molecules on T cells for CD44; N glycosylation of LSECtin CRD domain and CD44 molecules involved in the interaction of LSECtin and CD44 on the molecular recognition between LSECtin; as a negative regulator of T cells involved in the suppression of the immune response; knockdown of LSECtin increased in mice model of hepatitis symptoms; exogenous injection of LSECtin recombinant protein or plasmid can relieve symptoms of hepatitis. These results indicate that LSECtin can be used to prepare and treat or prevent autoimmune hepatitis.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及LSECtin的一种新用途。
技术介绍
机体对免疫功能主要执行者T细胞在不同器官不同细胞采用不同的调控分子进 行精细复杂的调控，以确保免疫稳定；免疫调控的失衡会导致多种病理免疫反应的 发生，如自身免疫性疾病、病原体感染的慢性化。对T细胞免疫调控机制的阐明不 仅为深刻理解机体的免疫动态平衡提供了理论基础，而且为一系列免疫性疾病的治 疗提出了新策略，目前针对T细胞功能调节的免疫治疗己成功应用于多种自身免疫 性疾病，移植排斥反应以及慢性病毒感染。如美国FDA批准的上市药物中，CD3抗 体(商品名0KT3)通过抑制T细胞激活的第一信号而抑制免疫反应从而应用于器官 移植；CTLA4融合蛋白(商品名BELATACEPT)通过抑制T细胞激活的第二信号从而 抑制免疫反应而用于类风湿关节炎、I型糖尿病和骨髓移植等；CTLA-4抗体(商品 名Ipilimuraab)通过抑制共抑制分子对的相互作用而用于黑色瘤的治疗。自身免疫性肝炎(AutoimmuneHepatitis, AIH)是一组病因不明、伴有明显自身 免疫现象，以炎症性坏死为主要病理改变的慢性肝脏疾病。AIH的免疫病理损伤机制 主要涉及两个方面(1)细胞介导的细胞毒作用CD4+T细胞被激活后分化为细胞 毒性T淋巴细胞，细胞毒性T淋巴细胞通过释放淋巴因子直接破坏肝细胞。已有研 究证明AIH患者的肝细胞组织中存在抗原致敏的疾病特异性的细胞毒性T淋巴细 胞。(2)细胞介导、抗体依赖的细胞毒作用在T细胞的协同作用下，AIH浆细胞 分泌产生大量的针对肝细胞抗原成分的自身抗体，它们与肝细胞膜上的蛋白成分起 反应，形成免疫复合物，自然杀伤细胞通过Fc受体识别这种免疫复合物，引起肝细 胞的溶解和破坏。对于自身免疫性肝炎，临床上主要用皮质类固醇或免疫抑制剂治 疗。其中免疫抑制治疗主要包括环孢菌素A， FK506(大环内酯类抗生素)，硫唑嘌呤 等。利福霉素、IL-10、 CTLA-4抗体已用于临床，新型免疫抑制剂FTY-720也有较好 的作用。LSECtin (Liver and lymph node Sinusoidal Endothelial Cells lectin)为贺福初等 在国际上率先克隆并研究的一种新的C-型凝集素，特异表达在肝脏和淋巴结，其基因与已知的C-型凝集素DC-SIGN、 DC-SIGNR和CD23基因紧密成簇排列于染色体 19pl3. 3区域，同属于II型C-型凝集素家族(Liu, W. W a/. Characterization of a novel C-type lectin-like gene, LSECtin: demonstration of carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells of liver and lymph node. c/5Zo/. C/zew. 279, 18748-18758,2004)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供LSECtin的一种新用途。本专利技术所提供的LSECtin的新用途是LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制 备预防和/或治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。凡是能表达LSECtin或含有LSECtin融合蛋白的重组载体都可以用于制备预防 和/或治疗自身免疫性肝炎的药物，如重组载体pcDNA3.1A-mLSECtin。本专利技术所提供的LSECtin的另一个新用途是筛选预防和/或治疗自身免疫性肝 炎药物的方法。本专利技术所提供的筛选预防和/或治疗自身免疫性肝炎药物的方法，包括以下步骤1) 构建LSECtin表达降低的转基因小鼠；2) 将所述转基因小鼠作为药物模型，筛选预防和/或治疗自身免疫性肝炎的候 选药物。所述转基因小鼠是将siRNA转入小鼠，得到LSECtin表达降低的转基因小鼠。 所述siRNA序列为序列表中序列1-5中的任意一种，优选为序列4或序列5。 上述LSECtin的核苷酸序列如GenBank Accession Number NM—198492的自5'末端第1至1302位脱氧核糖核苷酸的LSECtin基因，编码如GenBank AccessionNumber AAR84185的自氨基末端第1至293位氨基酸残基所示的蛋白质。表达LSECtin的重组质粒，如pcDNA3.1 A-mLSECtin也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术的能够降低LSECtin表达的siRNA干涉序列，其序列为序列表中序列1-5中的任意一种，优选为序列4或序列5。在实际应用中，可用LSECtin表达降低的转基因小鼠作为药物模型进行药物筛选，能够提高该转基因小鼠中LSECtin表达的药物即为预防和/或治疗自身免疫性肝炎的候选药物。本专利技术通过实验证明LSECtin表达在肝脏的K叩ffer细胞和窦内皮细胞；sLSECtin-Fc融合蛋白以及细胞膜表面的LSECtin均能粘附活化的外周血T细胞； LSECtin在活化T细胞上的配体分子为CD44; LSECtin的CRD结构域和CD44分子的N糖 基化参与了LSECtin和CD44分子对之间的相互识别；LSECtin做为一种T细胞的负调 控分子参与抑制免疫反应；敲低LSECtin的表达明显加重模型小鼠肝炎症状，反应T 细胞活性的细胞因子表达量显著上升；而外源注射LSECtin重组蛋白或质粒能缓解 肝炎症状。说明LSECtin可用制备预防和/或治疗自身免疫性肝炎的药物。 附图说明图1为LSECtin表达在肝窦内皮细胞和Kupffer细胞a为LSECtin表达在肝窦内皮细胞和Kupffer细胞b为流式细胞术检测LSECtin表达在肝窦内皮细胞表面c为LSECtin与CD68共定位于Kupffer细胞图2为LSECtin识别活化T细胞a为LSECtin蛋白识别活化外周血T细胞b为膜表面LSECtin识别活化外周血T细胞图3为LSECtin在活化T细胞表面的配体为CD44a， b为LSECtin在T细胞表面配体的分子量为140kD和80kDc为质谱鉴定提示LSECtin候选配体分子为CD44d为CD44封闭性抗体能抑制LSECtin与活化T细胞的结合图4为LSECtin与CD44相互作用a， b为细胞粘附实验证实LSECtin与CD44相互作用c， d为ELISA实验证实LSECtin与CD44相互作用图5为LSECtin识别CD44的N-连接糖复合物a为LSECtin识别活化T细胞被单糖所抑制b为LSECtin识别活化T细胞被N-连接糖基化抑制剂所抑制c为LSECtin与CD44相互作用被N-连接糖基化抑制剂所抑制图6为LSECtin负调节T细胞a为LSECtin蛋白抑制T细胞的增值b为LSECtin蛋白抑制T细胞的活化c为LSECtin蛋白促进活化T细胞的凋亡d为LSECtin蛋白下调细胞因子的表达图7为注射LSECtin蛋白或质粒缓解自身免疫性肝炎 a为注射LSECtin蛋白降低小鼠血清ALT/AST水平 b为注射LSECtin蛋白缓解肝组织损伤 c为注射全长LSECtin质粒降低小鼠血清ALT/AST水平 d为注射全长LSECtin质粒缓解肝组织损伤 图8为敲低LSEC本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＬＳＥＣｔｉｎ或含有ＬＳＥＣｔｉｎ的融合蛋白在制备预防和／或治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。

【技术特征摘要】
1、LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白在制备预防和/或治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。2、 表达LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白的重组载体在制备预防和/或治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述表达LSECtin的重组载体 为pcDNA3.1 A-mLSECtin 。4、 一种筛选预防和/或治疗自身免疫性肝炎药物的方法，包括以下步骤1) 构建LSECtin表达降低的转基因小鼠；2) 将所述转基因小鼠作为药物模型，筛选预防和/或治疗自身免疫性肝炎的候 选药物。5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述转基因小鼠是将siRNA转 入小鼠得到LSECtin表达降低的转基因小鼠。6、 根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺福初，唐丽，杨俊涛，刘万里，张令强，应万涛，尹秀山，唐哓明，陈婕，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]