乙型肝炎病毒耐阿德福韦变异病毒株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ＨＢＶ突变株，该突变株的聚合酶区发生了ｒｔＥ２１８Ｇ突变。本发明专利技术还公开了所述病毒株在筛选抗ＨＢＶ药物中的应用，以及检测ｒｔＥ２１８Ｇ突变的相关检测试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物
，具体涉及一株耐阿德福韦的乙型肝炎病毒(HBV) 变异株，本专利技术还涉及其检测试剂以及该病毒株在耐药性监测，交叉耐药性分析、药物筛选 和新药物的发现等多方面的应用。
技术介绍
阿德福韦酯是腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韦(ADV)的前药，口服后可迅速水解为 ADV而发挥抗病毒作用。ADV是广谱抗病毒药物，为核苷类病毒逆转录酶抑制剂，通过抑制 HBV的复制而发挥抗病毒作用。研究已证实，ADV对HBeAg阳性或HBeAg阴性的慢性乙型肝 炎患者均有很好的疗效和安全性。现已作为一线药物应用于慢性乙型肝炎的抗病毒治疗。与其他核苷类药物一样，ADV治疗中，也会发生HBV DNA耐药突变，从而导致ADV耐 药。研究表明，ADV治疗慢性乙型肝炎患者过程中，第1-5年的耐药突变发生率分别为0%、 3%、11%、18%和 29%。最常见的ADV耐药突变是HBV聚合酶D区的rtN236T和B区的rtA181V/T。在 ADV治疗初期，几种突变可以伴随发生，也可单独出现，但随着疗程的增加，rtA181V常伴随 rtN236T而出现。在体外药敏试验中，与野生株病毒相比，rtN236T变异病毒株对ADV的敏 感性下降了 3.9至13.8倍，而汁々181￥变异株下降了 2. 5至3. 0倍。已有多项研究指出， rtN236T的出现改变了复制催化活性区内氨基酸的极性，使得HBV聚合酶的折叠发生了变 化，因此在复制阶段不利于其与底物的结合，从而导致复制过程受阻碍。而rtA181V的出 现，在一定程度上校正了氨基酸极性上的变化，使得发生rtN236T突变后，聚合酶折叠更接 近于原来状态，有利于耐药性变异病毒株的复制传代。此外，体内试验和体外试验的数据均 提示，rtA181V变异对拉米夫定的敏感性不及rtN236T变异。这很可能是因为rtA181V变 异与拉米夫定的rtL180M相毗邻，所以任何一种变异的发生都会对其产生邻位效应。突变rtN236T和rtA181V对HBeAg阴性和阳性患者的影响不完全相同。ADV耐药 现象在低病毒血症且HBeAg阳性患者中的发生率相当低，耐药的发生也部分体现在ALT的 升高上。对于HBeAg阴性的患者来说，ADV治疗48周后停药，治疗获益常在停药1 2年后 消失。但若继续用药直至144周，患者在治疗48周时所获得的病毒学、血清生化及组织学 等各方面改善，将被保留且进一步好转。期间耐药发生率很低，且负面作用与初始的48周 治疗时相似。目前，ADV也常用于前期拉米夫定治疗失效的患者。早期48周及96周临床试验均 提示，无论是野生型还是YMDD突变型病毒株，均对ADV敏感，治疗后HBV DNA下降呈指数趋 势，且患者的耐受性良好。故两种药物联合应用更加有效地抑制了病毒的复制，但也可能发 生聚合酶区的rtL180M+M204V和rtN236T联合突变，对拉米夫定和ADV产生双重耐药。尽 管研究表明，拉米夫定耐药株对ADV敏感，但对HBV本身来说，三种变异联合增加了对ADV 的耐药水平，与rtN236T单突变相比，对ADV的敏感性下降了 2倍。在分子水平，联合突变 导致底物结合位点更难与阿德福韦结合，因此进一步降低了对ADV的敏感性。迄今为止，学者们发现不但HBV聚合酶基因区的rtA181V、rtN236T变异可引起ADV 相关耐药，其他许多与ADV相关的突变，例如rtI233V、rtS85A、rtS85P、rtSl 19A、rtH133L、 rtV214A、rtH234Q、rtP237H和rtN238D等，也可能与ADV耐药有关。然而，仍有许多慢性乙 型肝炎患者，在ADV治疗中出现临床耐药，却检测不出已知变异位点的存在。故ADV相关 HBV突变的研究还需要进一步的探索。
技术实现思路
本专利技术的目的是，找到引起ADV耐药的HBV新变异位点和相应的HBV突变病毒株， 提供此新变异位点的检测方法和检测试剂盒，提供相应HBV突变病毒株的鉴定方法和鉴定 试剂盒，以及此新变异位点和相应的HBV突变病毒株在筛选抗HBV药物，监测耐药突变等方 面的应用。本专利技术发现rtE218G突变，即HBV DNA聚合酶区218位的氨基酸密码子由GAG突 变为GGG，该突变是与ADV耐药相关的新的HBV基因突变位点。体外表型实验结果显示， rtE218G突变病毒株能够独立引起对ADV的耐药，其IC5tl是野生病毒株的5. 5倍。rtE218G 突变株在体外的复制能力有所降低，大约是野生株的87%。本专利技术还提供rtE218G突变株在筛选抗病毒药物中的应用。可以利用该突变株对 其他抗HBV药物进行交叉耐药性分析和用药筛选。本领域技术人员还可以进一步将含有 rtE218G突变位点的DNA片段克隆到载体中，并且可以进一步将所述载体导入相应的宿主 细胞中，以便于使用和保存。本专利技术还提供几种检测rtE218G突变位点和鉴定相应HBV突变病毒株的方法，包 括1、特异性探针杂交法用针对rtE218G突变位点的探针与待检HBV DNA片段进行 杂交，通过检测杂交结果，判断是否发生了 rtE218G突变。可以采用反向探针杂交法，即将 所述探针固定在固相载体上，将带有标记的待检DNA片段与之杂交，洗掉未杂交的序列，进 而检测杂交结果。按照这种原理，可进一步采用以下两种方法进行杂交检测1)反向线性探针杂交法基于探针杂交原理，先设计合成一系列探针，覆盖突变 高发区，其中S系列探针针对野生株序列，R系列探针含数个有常见突变序列的探针，还可 以设计一个有种属特异性的探针，将这一系列探针顺次固定于同一杂交膜上，在严格条件 下与亲和素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出突变有无及大 致位置。基于反向杂交的原理，扩增后的被生物素标记的HBV DNA产物，与平行线形式固定 在尼龙膜检测条上的特异性寡核苷酸探针杂交。杂交后，未能杂交的DNA从检测条上被洗 脱。随后加入标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素，与杂交产物上标记的生物素结合。最后加 入BCIP/NBT显色，显现紫色/棕色，从而判断结果。2)基因芯片法利用杂交的原理，即DNA根据碱基配对原则，在常温下和中性条件 下形成双链DNA分子，但在高温、碱性或有机溶剂等条件下，双螺旋之间的氢键断裂，双螺 旋解开，形成单链分子(称为DNA变性，DNA变性时的温度称Tm值)。变性的DNA黏度下降， 沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。当消除变性条件后，变性DNA两条互补链可以重 新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后DNA，其理化性质能得到恢复。 利用DNA这一重要理化特性，将两个以上不同来源的多核苷酸链之间由于互补性而使它们在复性过程中形成异源杂合分子的过程称为杂交(hydridization)。杂交体中的分子不是 来自同一个二聚体分子。由于温度比其他变性方法更容易控制，当双链的核酸在高于其变 性温度(Tm值)时，解螺旋成单链分子；当温度降到低于Tm值时，单链分子根据碱基的配对 原则再度复性成双链分子。因此通常利用温度的变化使DNA在变性和复性的过程中进行核 酸杂交。核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成即出现稳 定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＢＶ突变株，其特征在于，该病毒株的聚合酶基因２１８位的氨基酸密码子由ＧＡＧ突变为ＧＧＧ，即发生了ｒｔＥ２１８Ｇ突变。

【技术特征摘要】
CN 2009-5-4 200910083422.9一种HBV突变株，其特征在于，该病毒株的聚合酶基因218位的氨基酸密码子由GAG突变为GGG，即发生了rtE218G突变。2.一种鉴定权利要求1所述HBV突变株的方法，其步骤包括1)采用PCR扩增含有rtE218G突变位点的目的DNA片段；2)扩增产物用限制性内切酶进行酶切，所述限制性内切酶的识别序列包含所述 rtE218G突变位点；3)步骤2)中的酶切产物进行琼脂糖电泳，根据不同的切割条带来判断是否发生了 rtE218G 突变。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)中扩增目的DNA片段的引物对为Bl 和B2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 1所示。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的限制性内切酶为BanI内切酶。5.一种鉴定权利要求1所述HBV突变株的方法，其步骤包括1)采用PCR扩增包含rtE218G突变位点的DNA片段；2)对步骤1)中扩增的DNA片段进行核苷酸序列测定；3)根据测序结果判断是否发生了rtE218G突变。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤1)中采用的PCR为套式PCR。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于套式PCR所使用的外侧引物对为SA和P0，其 核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 7所示。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于套式PCR所使用的内侧引物对为BSE和1164， 其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 19所示。9.一种鉴定权利要求1所述HBV突变株的方法，其步骤包括1)根据突变位点，设计合成序列特异性引物；2)PCR扩增目的DNA片段，通过检测特异扩增产物的有无，来判断是否发生了 rtE218G突变。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于步骤2)中使用的PCR为定量PCR。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于PCR扩增所使用的序列特异性引物为F1，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于与Fl配对使用的另一条引物为F2，其核苷 酸序列如SEQ ID NO. 4所示。13.如权利要求10所述的方法，其特征在于荧光定量PCR使用核苷酸序列如SEQID NO. 5所示的荧光标记探针。14.一种鉴定权利要求1所述HBV突变株的方法，其特征在于用针对rtE218G突变位点 的探针与待检HBV DNA片段，通过检测杂交结果，来判断是否发生了 rtE218G突变。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述探针固定在杂交膜上，通过PCR法获 得带有标记的包含待检位点的HBV DNA片段，将所述DNA片段与探针杂交，洗掉未杂交的 DNA片段，检测杂交结果，来判断是否发生了 rtE218G突变。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于所述标记为生物素标记，杂交后加入标记 有碱性磷酸酶的链霉亲和素，使其与杂交产物上标记的生物素结合，最后加入BCIP/NBT显色，进而根据杂交结果，来判断是否发生了 rtE218G突变。17.一种鉴定权利要求1所述HBV突变株的方法，其特征在于根据连接酶链反应方法， 针对rtE218G突变设计两条与HBV突变株DNA互补的两个相邻寡核苷酸链，其中一条寡核 苷酸链与另一条相邻的一端与rtE218G突变位点的碱基互补，以待检HBV DNA为模板进行 连接酶链反应，检测连接产物，判断是否发生rtE218G突变。18.—种检测试剂，其特征在于，该试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏来，杜绍财，刘丽君，王江华，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11