耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法技术

耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，它涉及噬菌体的制备方法。它解决了现有解决现有绿脓杆菌噬菌体的分离方法存在分离纯化效果差的问题。方法：一、取污水样品；二、制备裂解液；三、裂解液与绿脓杆菌宿主菌悬液混合１培养，得混合液；四、制备单个噬菌斑；五、取噬菌体接入含有绿脓杆菌的培养基内培养至绿脓杆菌完全溶解，过滤后即完成。本发明专利技术中绿脓杆菌噬菌体的制备方法简单，且分离纯化效果好，无噬菌体断裂的现象。本发明专利技术制备所得耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体，用于制作自身（疫苗）生物制剂，治疗耐药绿脓杆菌感染引起的疾病，尤其是表皮感染性疾患，作为外用喷剂使用，可避免由于使用抗生素而产生的耐药性绿脓杆菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及噬菌体的制备方法。
技术介绍
在临床上由于抗生素的滥用导致细菌耐药性不断增长，使得细菌感染性疾病特 别是耐药性细菌的感染问题成为临床治疗的全球性难题。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa. PA)又称绿脓杆菌是临床上获得性感染中重要的条件致病菌之一。我国全国性 医院内病原菌耐药性监测(NPRS)数据显示铜绿假单胞菌在所有院内感染革兰阴性菌中 排第1位，随着抗生素的应用日益广泛，临床上出现了大量多重耐药的PA菌株，这对临床治 疗PA感染造成极大的困难。噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现其特异的噬 菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便、阴沟污水及医院污 水中含有大量绿脓杆菌，故也能很容易地分离到绿脓杆菌噬菌体。噬菌体是以特定的细菌 菌株为靶标，可使患者免受因正常菌群被破坏而引起的副作用.噬菌体的另一优点是它们 能够以指数生长，会紧随细菌增殖而生长、随细菌消失而消失.并且噬菌体还能在细菌进 化的同时发生突变，即使细菌对一种噬菌体产生耐受，自然界还存在着大量的甚至能进行 更新的耐受菌的噬菌体种类.由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来， 所以，(a)在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可 利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而 可分离到特异的噬菌体；(b)在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌而 形成透明的空斑，称噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌 体进行纯化与测定噬菌体的效价。对于分离到的绿脓杆菌噬菌体，再经过进一步筛选，应用 绿脓杆菌的11个标准型，对噬菌体进行宽噬筛选，为下一步研究绿脓杆菌噬菌体外用制剂 奠定基础，绿脓杆菌噬菌体只是外用制剂中几种成分之一。目前，有关噬菌体方面的科研工作，开展的比较多，主要集中在噬菌体的性质及分 类方法方面，在实际应用的分离方法方面，特别是针对某一种噬菌体，例如绿脓杆菌噬菌体 的分离方法多种多样，参差不齐，分离纯化效果不理想(离心条件控制不精确，将导致分离 的噬菌体断裂等)，使后续科研工作困难重重。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有绿脓杆菌噬菌体的分离方法存在分离纯化效果差 的问题，而提供。按以下步骤进行一、取IL医院污水，纱布 过滤后加入CaCl2至浓度为lmmol/L，搅拌后离心并取上清液，得污水样品；二、向500ml三 角瓶中加IOOml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基、200ml污水样品和2ml绿脓杆菌菌悬液，然后在37°C摇床160r/min震荡增殖培养12 24h，离心后取上清液并过滤，再在37°C 下培养过夜，经无菌检查合格，得裂解液；三、取一环裂解液接种于LB液体培养基内，然后 加入0. Iml浓度为IO7 108pfu/ml的绿脓杆菌宿主菌悬液，室温下混合15min，得混合液； 四、取LB培养基溶化并冷却至48°C，然后加入0. 2ml混合液并混勻，再倒入LB固体培养基 上并于37°C下培养24h，得单个噬菌斑；五、用接种针在单个噬菌斑中刺一下，取噬菌体，然 后接入含有绿脓杆菌的LB液体培养基内，于37°C下培养至绿脓杆菌完全溶解，过滤后，即 完成耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备。本专利技术中绿脓杆菌噬菌体的制备方法简单，且分离纯化效果好，无噬菌体断裂的 现象。本专利技术制备所得耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体，用于制作自身(疫苗)生物制剂，治疗耐 药绿脓杆菌感染引起的疾病，尤其是表皮感染性疾患，作为外用喷剂使用，可避免由于使用 抗生素而产生的耐药性绿脓杆菌。附图说明图1为具体实施方式中一噬菌体的透视电镜图。 具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的 任意组合。具体实施方式一本实施方式按以下步骤进 行一、取IL医院污水，纱布过滤后加入CaCl2至浓度为lmmol/L，搅拌后离心并取上清液， 得污水样品；二、向500ml三角瓶中加IOOml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基、200ml 污水样品和2ml绿脓杆菌菌悬液，然后在37°C摇床160r/min震荡增殖培养12 24h，离心 后取上清液并过滤，再在37°C下培养过夜，经无菌检查合格，得裂解液；三、取一环裂解液 接种于LB液体培养基内，然后加入0. Iml浓度为IO7 108pfU/ml的绿脓杆菌宿主菌悬液， 室温下混合15min，得混合液；四、取LB培养基溶化并冷却至48°C，然后加入0. 2ml混合液 并混勻，再倒入LB固体培养基上并于37°C下培养24h，得单个噬菌斑；五、用接种针在单个 噬菌斑中刺一下，取噬菌体，然后接入含有绿脓杆菌的LB液体培养基内，于37°C下培养至 绿脓杆菌完全溶解，过滤后，即完成耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备。本实施方式步骤一中医院污水为消毒处理前的医院污水。本实施方式步骤二中LB固体培养基在121°C下灭菌15 30min后使用。本实施方式步骤三中LB液体培养基在121°C下灭菌15 30min后使用。本实施方式中制备所得耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体，进行增殖后即可得到高效价的 耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体，具体步骤为将具体实施方式一步骤五中过滤后所得滤液与LB 液体培养基按1 10的比例混合，再加入绿脓杆菌菌悬液与滤液等量或1/2的量)，37°C下 增殖培养，并重复移种2 8次，过滤后，得高效价的耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体制品。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心采用 5000r/min的转速离心15min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中绿脓杆菌 菌悬液的制备绿脓杆菌接种于LB固体培养基上，37°C下培养17 26h，取单菌落接种于5ml无菌水中，即完成。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中离心 采用5000r/min的转速离心20min。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中过滤 采用孔径为0. 22 μ m的滤菌器。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤二中无菌 检查的过程在LB固体培养基上涂布50ul浓度为IO7 108pfu/ml的绿脓杆菌宿主菌悬 液，待绿脓杆菌宿主菌悬液干后，在上面分散滴加裂解液，然后在37°C下培养过夜，若形成 无菌生长的透明噬菌斑，则裂解液中含有绿脓杆菌噬菌体，即完成；其中LB固体培养基为 每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、12. 5g的琼脂、IOg的NaCl和余量的水组 成，PH值为7. 5。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中绿脓 杆菌宿主菌悬液的制备取绿脓杆菌宿主菌单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37°C摇床 160r/min培养8 18h，即完成。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，其特征在于耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法按以下步骤进行：一、取１Ｌ医院污水，纱布过滤后加入ＣａＣｌ２至浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，搅拌后离心并取上清液，得污水样品；二、向５００ｍｌ三角瓶中加１００ｍｌ三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基、２００ｍｌ污水样品和２ｍｌ绿脓杆菌菌悬液，然后在３７℃摇床１６０ｒ／ｍｉｎ震荡增殖培养１２～２４ｈ，离心后取上清液并过滤，再在３７℃下培养过夜，经无菌检查合格，得裂解液；三、取一环裂解液接种于ＬＢ液体培养基内，然后加入０．１ｍｌ浓度为１０７～１０８ｐｆｕ／ｍｌ的绿脓杆菌宿主菌悬液，室温下混合１５ｍｉｎ，得混合液；四、取ＬＢ培养基溶化并冷却至４８℃，然后加入０．２ｍｌ混合液并混匀，再倒入ＬＢ固体培养基上并于３７℃下培养２４ｈ，得单个噬菌斑；五、用接种针在单个噬菌斑中刺一下，取噬菌体，然后接入含有绿脓杆菌的ＬＢ液体培养基内，于３７℃下培养至绿脓杆菌完全溶解，过滤后，即完成耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备。

【技术特征摘要】
耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，其特征在于耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法按以下步骤进行一、取1L医院污水，纱布过滤后加入CaCl2至浓度为1mmol/L，搅拌后离心并取上清液，得污水样品；二、向500ml三角瓶中加100ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基、200ml污水样品和2ml绿脓杆菌菌悬液，然后在37℃摇床160r/min震荡增殖培养12～24h，离心后取上清液并过滤，再在37℃下培养过夜，经无菌检查合格，得裂解液；三、取一环裂解液接种于LB液体培养基内，然后加入0.1ml浓度为107～108pfu/ml的绿脓杆菌宿主菌悬液，室温下混合15min，得混合液；四、取LB培养基溶化并冷却至48℃，然后加入0.2ml混合液并混匀，再倒入LB固体培养基上并于37℃下培养24h，得单个噬菌斑；五、用接种针在单个噬菌斑中刺一下，取噬菌体，然后接入含有绿脓杆菌的LB液体培养基内，于37℃下培养至绿脓杆菌完全溶解，过滤后，即完成耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备。2.根据权利要求1所述的耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，其特征在于步骤一中 离心采用5000r/min的转速离心15min。3.根据权利要求1或2所述的耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，其特征在于步骤 二中绿脓杆菌菌悬液的制备绿脓杆菌接种于LB固体培养基上，37°C下培养17 26h，取 单菌落接种于5ml无菌水中，即完成。4.根据权利要求3所述的耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建华，曲晓军，于冲，夏海华，王金英，齐桂云，佟忠山，郭薇媛，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]