本发明专利技术涉及一种大肠杆菌噬菌体M13内标质控品的制备方法、应用和试剂盒，该方法制备的噬菌体M13内标质控品可作为在DNA病原体的荧光PCR核酸检测试剂盒的内标质控物质，在DNA病原体的PCR检测中能够准确地监控整个实验过程，以此可作为评判实验是否成功的标准。该方法制备的噬菌体M13内标质控品有很好的稳定性，易保存(冻干保存时间≥1年)，方便运输，安全性高，作为内标质控品可真正做到从样本处理到扩增的全程质量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及病原体诊断
，具体设及一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品 的制备、应用和试剂盒。
技术介绍
随着分子生物学技术的迅速发展，W聚合酶链式反应为基础的各种分子生物学诊 断技术，因其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，方便快捷等优点，称为生物医 学领域内最有价值的研究手段，已经广泛应用于临床标本的检测。在DNA病毒PCR检测中， 影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间溫度的差异、标 本核酸提取后抑制物的残留、待扩增祀核酸的浓度及试剂问题等，运些因素均可能会影响 PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，在做核酸扩增实验时，需要有严格的质量控制 措施，即需要有特定的质控物。质控物须具备W下特点：（1)易制备；(2)在胆存和使用过程 中稳定性好；（3)无生物传染性；(4)能监控整个检测过程，结果可靠。 传统的DNA病毒检测的内标有S种：样本中看家基因片段（We-actin为例）， 化及质粒DNA，假病毒，但运些质控品都有各自的弊端。样本中e-actin，若取样不成功直 接影响其结果的判断，虽然看家基因与目的基因为非竞争性扩增，但如果在样本中目的基 因与0 -actin的浓度相差10倍W上，直接干扰和影响目的检测片段的判断；质粒DNA虽然 稳定性好，但质粒易污染实验室。所W也不宜作为质控品对DNA进行监控；假病毒较之前面 两种，是比较理想的选择，但是其要求一定的技术支持，操作繁琐。严格的内标则是在反应 管加入含量一定含量的内标模板，通过内标含量的变化来监控整个PCR过程。 大肠杆菌隧菌体M13是包膜蛋白包裹结构的DNA结构，与DNA病毒相似，且M13无 致病性，可快速培养。将大肠杆菌隧菌体M13作为DNA的PCR检测的内标质控品的研究具 有重要意义。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备 方法。 具体技术方案如下： -种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备方法，包括W下步骤： (1)宿主菌的制备：挑大肠杆菌邸2738菌种接种在固体培养基上培养；再挑取单 菌落接种至液体培养基中，扩大培养，得到含宿主菌的培养液； (2)隧菌体M13单克隆的制备：挑隧菌体M13用双层琼脂平板培养法培养18-24小 时，再挑取单个隧菌斑至含宿主菌的液体培养基中培养20-2地，得到含隧菌体M13的培养 液； (3)隧菌体M13的扩大培养：将步骤（1)制备的含宿主菌的培养液接种到液体培 养基中，培养4-5小时，得到细菌培养液，再将步骤（2)制备的含隧菌体M13的培养液接种 到细菌培养液中，培养过夜，取培养液离屯、，收集上清液，过滤即得到纯化的隧菌体M13悬 液； (4)隧菌体M13的分析检测：取步骤（3)制备的隧菌体M13用巧光PCR法检测Ct 值，并用双层琼脂法测效价； (5)隧菌体M13内标质控品的制备：用冻干稀释液将隧菌体M13悬液稀释至Ct值 为18-20,分装于离屯、管中，真空冷冻干燥，所得冻干品冷冻保存。 在其中一个实施例中，步骤（4)所述巧光PCR法检测Ct值针对隧菌体M13的扩增 引物为沈QIDNO:4和沈QIDNO:5。 在其中一个实施例中，步骤（4)所述巧光PCR法检测Ct值针对隧菌体M13的探针 为沈QIDNO:6。 在其中一个实施例中，步骤（5)所述冻干稀释液为含有质量分数为0.8-1.2%的 牛血清白蛋白和体积分数为45-55 %的吐溫20的水溶液。 在其中一个实施例中，步骤（5)所述真空冷冻干燥的溫度为-50°C，压力为 0. 2mTorr，所述冷冻保存的溫度为-20°C。 本专利技术的另一目的在于提供一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品。 具体技术方案如下： 一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品，由本专利技术上述制备方法制备而成。 本专利技术的另一目的在于提供上述大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的应用。 具体技术方案如下：[002引上述大肠杆菌隧菌体M13内标质控品在DNA病原体的巧光PCR检测过程中作为内 柄质巧品的应用。 本专利技术的另一目的在于提供一种DNA病原体巧光PCR检测试剂盒。 具体技术方案如下：[002引一种DNA病原体巧光PCR检测试剂盒，包含检测试剂和内标质控品，所述内标质控 品为上述大肠杆困隧困体M13内柄;质巧品。 本专利技术提供了隧菌体M13内标质控品的制备方法，该方法制备的隧菌体M13内标 质控品可作为内标质控品在DNA病原体的巧光PCR检测中准确地监控整个实验过程，W此 可作为评判实验是否成功的标准。该制备方法中利用真空冷冻干燥技术将隧菌体M13制备 成冻干品，冻干品的性能更稳定，易保存。与现有的其它内标质控品相比，隧菌体M13作为 DNA的PCR检测的内标质控品具有很好的稳定性，易保存（冻干保存时间> 1年），方便运 输。在核酸提取中，对病原体内DNA有很好的模拟作用，由于表达产物为隧菌体病毒颗粒可 真正做到从样本处理到扩增的全程质量检测。隧菌体M13安全性高，易于体外培养，可通过 细菌培养即可获取，极为方便。【附图说明】 图1为实施例1中大肠杆菌隧菌体M13梯度稀释液的巧光PCR检测结果； 图2为实施例1中大肠杆菌隧菌体M13的效价测试图； 图3为实施例2中大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的均匀性巧光PCR检测结果； 图4为实施例4中ADV腺病毒的巧光PCR检测结果；[003。图5为实施例4中大肠杆菌隧菌体M13作为内标质控品的巧光PCR检测结果。【具体实施方式】 为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，运 些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，按照常规实验方法进行。 冻干稀释液：含有质量分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为50%的吐溫20的 水溶液； 样品稀释液：超纯水。[003引实施例1 :大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备 1、宿主菌的制备 先用接种环挑出一点大肠杆菌邸2738菌种接种在LB固体培养基上过夜培养；挑 取1移菌环细菌至IOmLLB液体培养基中，过夜培养，得到含宿主菌的培养液； 2、隧菌体M13单克隆的制备 取出0. 5ml的隧菌体，用LB液体培养基10倍梯度稀释，取IOOuL梯度稀释的隧菌 体菌液与300uL步骤1制备的含宿主菌的培养液混匀，静置15分钟，同4mL45°C的LB半固 体培养基混匀，然后倒入准备好的LB固体培养基（含IPTG/Xgal)中，待凝固后放入37°C培 养箱培养18-24小时。挑取单个隧菌斑至含有用步骤1的方法培养化的大肠杆菌的LB液 体培养基中，37°C，200r/min，摇菌2地，收获得到含隧菌体M13的培养液； 3、大量隧菌体M13制备 (1)步骤1制备的含宿主菌的培养液按照1:20的体积比接种到LB液体培养基中， 37°C，200巧m震荡培养4-5小时后，得细菌培养液，按照1:20的体积比将步骤2制备的隧菌 体M13的培养液接种到上述细菌培养液中； (2)将接种后的细菌培养液在37°C，200巧m震荡培养过夜，取培养液在1000 Og下 离屯、lOmin，收集上清液，用孔径0. 22um的膜过滤即得到纯化的隧菌体M13悬液； 4、隧菌体M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大肠杆菌噬菌体M13内标质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)宿主菌的制备：挑大肠杆菌ER2738菌种接种在固体培养基上培养；再挑取单菌落接种至液体培养基中，扩大培养，得到含宿主菌的培养液；(2)噬菌体M13单克隆的制备：挑噬菌体M13用双层琼脂平板培养法培养18‑24小时，再挑取单个噬菌斑至含宿主菌的液体培养基中培养20‑24h，得到含噬菌体M13的培养液；(3)噬菌体M13的扩大培养：将步骤(1)制备的含宿主菌的培养液接种到液体培养基中，培养4‑5小时，得到细菌培养液，再将步骤(2)制备的含噬菌体M13的培养液接种到细菌培养液中，培养过夜，取培养液离心，收集上清液，过滤即得到纯化的噬菌体M13悬液；(4)噬菌体M13的分析检测：取步骤(3)制备的噬菌体M13用荧光PCR法检测Ct值，并用双层琼脂法测效价；(5)噬菌体M13内标质控品的制备：用冻干稀释液将噬菌体M13悬液稀释至Ct值为18‑20，分装于离心管中，真空冷冻干燥，所得冻干品冷冻保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔红，李哲群，商兴芳，吴秋保，曾家琨，
申请(专利权)人：广州呼研所生物技术有限公司，广东和信健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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