一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法。该方法是选择鸭感染里默氏杆菌４２－ＫＤ外膜蛋白基因和大肠杆菌ｐｈｏＡ基因合成了两对特异性引物用于两种病菌的基因扩增，其扩增片段大小分别为８０９ｂｐ和６２２ｂｐ，两者大小相差１８７ｂｐ，建立的ＲＡ和Ｅ．ｃｏｌｉ两重ＰＣＲ方法能快速、特异、敏感地检测并同时鉴别这两种细菌。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术方法与传统的鉴别诊断方法相比较，需要的费用更低、效率更高、特异性更强。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法，其特征在于，选择鸭感染里默氏杆菌４２－ＫＤ外膜蛋白基因和大肠杆菌ｐｈｏＡ基因合成了两对特异性引物用于两种病菌的基因扩增，其扩增片段大小分别为８０９ｂｐ和６２２ｂｐ，两者大小相差１８７ｂｐ，建立的ＲＡ和Ｅ．ｃｏｌｉ两重ＰＣＲ方法能快速、特异、敏感地检测并同时鉴别这两种细菌。检测方法步骤如下：　　１）增菌培养基的制备　　增菌培养基按下列方法进行配制：　　将ＮａＣｌ、胰蛋白胨和牛肉汤混匀，在ＰＨ值７．２～７．４、温度１２１℃或１ｌ凝胶电泳加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中，同时设置标准分子量ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ对照，以５Ｖ／ｃｍ胶长的稳压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端２ｃｍ～３ｃｍ时停止；　　将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外线透射仪上观察，与标准ＤＮＡ分子量及阳性对照比较分析，判定结果，并用凝胶成像系统拍照保存；　　若应用二重ＰＣＲ，被检样品在８０９ｂｐ的片段位置上出现一条ＤＮＡ扩增带，判定为ＲＡ阳性，记为ＲＡ“＋”；被检样品在６２２ｂｐ的片段位置上出现一条ＤＮＡ扩增带，判定为Ｅ．ｃｏｌｉ阳性，记为Ｅ．ｃｏｌｉ“＋”；若被检样品在该两处位置无ＤＮＡ扩增带出现，则判定为ＲＡ和Ｅ．ｃｏｌｉ阴性，记为ＲＡ（－）和Ｅ．ｃｏｌｉ（－）。０７．９ｋＰａ高压条件下，灭菌１５ｍｉｎ；培养基冷却至室温，无菌加入小牛血清使之最终浓度为１０％，混匀后可使用或密封放置室温保存备用；　　２）待检样品的准备　　Ａ．细菌平板分离物：　　用巧克力平板对疑似病鸭进行细菌分离，在烛缸中培养２４～４８小时后取平板上生长的菌落，用无菌生理盐水作１０－９的稀释；　　Ｂ．细菌增菌培养物：　　将病死鸭的脑组织，研磨后用灭菌生理盐水１∶５的重量比例稀释，稀释病料中加入增菌培养基５００μＬ，稀释病料在培养基里的比例为２０％，３７℃摇振培养４ｈ～８ｈ，将培养物１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心，去除上清４００μＬ，剩余的培养物吹打均匀，留作抽提ＤＮＡ用；　　３）待检样品ＤＮＡ抽提　　取待检病鸭的细菌平板分离物或者细菌增菌培养物的样品约５０μｌ，于１．５ｍＬ离心管中，置９９℃水浴１０～１５ｍｉｎ，获得模板ＤＮＡ，用于ＰＣＲ扩增或置－２０℃保存；　　４）ＰＣＲ检测　　Ａ．ＤＮＡ抽提　　将细菌平板分离物和细菌增菌培养物９９℃水浴１０～１５ｍｉｎ处理后，－２０℃保存备用；　　Ｂ．反应液配置　　在冰浴条件下，按下...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，尤岩岩，韦天超，杨宗维，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]