脐带华通胶来源的间充质干细胞在心力衰竭细胞移植治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用，包括心肌梗死后引起的慢性缺血性心力衰竭、终末期缺血性心力衰竭，及原发性扩张性心肌病和心肌炎后继发心肌病所致的心力衰竭。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物材料在医疗领域的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制备的间充质干细胞，在制备因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料方面的 应用。
技术介绍
全球每年有约1700万人死于心血管疾病。虽然随着药物治疗、介入技术和外科 手术水平的提高，急性心肌梗死的病死率明显下降，但循证医学发现，即使早期成功接 受再血管化治疗的急性心肌梗死患者中，仍有超过30%的患者发展为缺血性心力衰竭， 甚至进一步发展为终末期缺血性心力衰竭。终末期缺血性心力衰竭是指①有心肌梗死 史；②有严重心力衰竭临床表现并反复住院；③强化内科药物治疗无效；④无内科介入 及外科搭桥手术指征；⑤左心室射血分数(LVEF)小于40% 。终末期缺血性心力衰竭年 死亡率在60%以上。对终末期缺血性心力衰竭所能采取的治疗手段仅有两项①心脏移 植；②安装心室辅助装置。心脏移植因为手术耐受、供体、免疫排斥等原因不可能广泛 使用；安装心室辅助装置则仅适用于短期支持过渡期严重血液动力学障碍急性患者，不 能长期维持应用。因此，当前国际医学界尚无有效方法逆转终末期缺血性心力衰竭患者 的病情。 除缺血性心脏病所致的心力衰竭，扩张性心肌病是慢性心力衰竭又一常见原 因，其中包括病因不清的特发性心肌病和继发于心肌炎后的心肌病。扩张性心肌病引起 的慢性心力衰竭l年病死率约25-30%，心脏移植是唯一有效治疗措施。由于受供体来源 和技术的限制，全球心脏移植每年只有三千余例，中国仅数十例。 当代细胞生物学的发展给这些慢性心力衰竭患者带来了新的希望。临床研究发 现，自体骨髓单个核细胞、自体骨髓间充质干细胞，以及内皮祖细胞、骨髓侧群细胞等 成体干细胞移植治疗缺血性心力衰竭、陈旧性心肌梗死及心肌梗死后心衰，可以不同程 度改善心脏收縮和舒张功能、阻止左室重构、改善预后。 然而，细胞疗法在临床应用中遇到了来自种子细胞的重重障碍应用胚胎干细 胞存在伦理、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；应用自体成体干细胞遇到更多问题， 诸如①骨髂肌成肌细胞移植存在严重致心律失常性；②骨髓单个核细胞移植成分复杂， 所含具有多向分化潜能的干细胞数量低，分化潜能有限；③造血干细胞CD34不能分化 为心肌细胞表型；④CD133细胞移植可致冠脉支架再狭窄；⑤内皮祖细胞改善心功能作 用有限；⑥骨髓间充质干细胞(MSCs)材料来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长 而明显下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康人，体外长时间 扩增降低体内分化归巢潜能；⑦与自体MSCs相比，脐血MSCs有诸多优点，但脐血源 MSCs分离效率低，限制了其广泛应用。总之，当前尚无一种理想的种子细胞满足对这些 慢性心力衰竭患者实施细胞生物学治疗的临床需求，需要突破的技术瓶颈是解决多能干3细胞的来源。 本专利技术人的在先专利申请200910157731.6脐带华通胶间充质干细胞的制备方 法及其产品为心力衰竭患者实施细胞生物学治疗提供了新的物质基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，将脐带华通胶来源的间充质干细胞应用于因冠心 病及扩张性心肌病引起的慢性心力衰竭患者，作为对其实施细胞移植治疗的材料，用以 改善以上这些慢性心力衰竭患者的生存质量，降低死亡率；同时克服冠心病及老年患者 自体干细胞分化增殖及旁/自分泌功能减低不能达到有效的生物学效应的缺陷。 本专利技术所称脐带华通胶来源的间充质干细胞，英文名称为Umbilical Cord Wharton' s Jelly-Derived MSCs， UW-MSCs，是按以下方法制备的 取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液，去除 脐动脉、脐静脉及脐带外膜，剥离华通胶并剪切成小块，再以等渗的平衡盐溶液或无血 清培养液冲洗后，浸泡于0.05 0.3%胶原酶溶液中，置于35 37.5t:温箱中10 30 小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1 10倍量的含胎牛血清的培 养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CC^培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清 的培养基溶液，以后每隔2 4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2 4 代，即时使用或冷冻保存备用。 本专利技术所称脐带华通胶来源的间充质干细胞在生物学表型鉴定中，具有以 下技术特征①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长；②表达CD90、 CD105、 CD44 ; HLA-ABC ;不表达CD45、 CD34， HLA-DR ;③体外可诱导分化为成骨细胞和 脂肪细胞。 本专利技术方法所用细胞移植材料，可以即时使用刚刚完成传代培养2-4代的UW-MSCs新鲜品，也可以使用冷冻保存的传2-4代UW-MSCs备用品。 本专利技术所称因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭包括心力衰竭的两个类别 一类为因冠心病引起的心力衰竭，包括慢性缺血性心力衰竭(Chronic ischemic heartfailure, CIHF)及终末期缺血性心力衰竭(end-stage ischemic heart failure, EIHF);另一类为扩张性心肌病引起的心力衰竭，包括原发性扩张性心肌病及心肌炎后继发心肌病所致心力衰竭。 应用本专利技术方法，移植UW-MSCs手术方法有①经静脉快速注入UW-MSCs悬 液；②经冠状动脉超选择性移植UW-MSCs ;③经冠状动脉选择性移植UW-MSCs ; 经 心内膜心肌注射器直接心肌注射移植UW-MSCs。 本专利技术UW-MSCs移植治疗冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病所致慢性心力衰竭 的机理是利用UW-MSCs较自体干细胞更强的自我更新及多向分化潜能，及归巢与旁/ 自分泌功能，释放大量生物因子，促进血管和心肌再生等生物学效应来修复心肌和改善心 功能，改善这些慢性心力衰竭患者的近期和远期预后。 本专利技术所应用的脐带华通胶来源的间充质干细胞，其性能介于胚胎干细胞与成 体干细胞之间，以其替代患者自体干细胞应用于治疗心力衰竭，解决了目前细胞疗法中 困扰医学界的多个问题，如①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤4性等问题；②成体干细胞存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等缺陷；③冠心病患 者抽取自体骨髓医从性差、MSCs增殖能力差、剂量不足等问题；④免去体外过长时间 培养及病人长时间等待；⑤可以从根本上改善冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病等所致 的慢性心力衰竭患者的预后，尤其是解决该病高死亡率问题。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1 UW-MSCs移植材料的准备——应用UW-MSCs新鲜品 将刚刚完成传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品，以0.05-0.25%胰 酶消化l-5分钟，血清中和，平衡盐溶液洗涤3遍，离心机的离心力控制在100-1000g， 应用含0-100单位肝素/毫升0.9%氯化钠注射液重悬使用。 实施例2 UW-MSCs移植材料的准备——应用冷冻保存的UW-MSCs备用品 从低温容器中取出冻存的传2-4代脐带华通胶间充质干细胞，迅速放入35-38t: 温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后 重新消化、洗涤细胞，使用浓度为肝素1000单位0.9%氯化钠溶液100毫升的肝 本文档来自技高网...

【技术保护点】
脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用。

【技术特征摘要】
脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用。2. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为慢性缺血性心力衰竭。3. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为终末期缺血性心力衰竭。4. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为原发性扩张性心肌病所致心力衰竭。5. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为心肌炎后继发心肌病所致心力衰竭。6. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为完成2-4代传代培养的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品。7. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为经传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞冷冻保存品。8. 根据权利要求7所述的脐带...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，陈宇，杨晔，丁青艾，朱智明，曹毅，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军总医院，
类型：发明
国别省市：11[]