一种冷冻保存红细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种冷冻保存红细胞的方法，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或Ｎ－乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，还原剂终浓度各为０．５～３００ｍＭ；甘油的量以终体积比计为５％～１０％；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为０．１～１０ｍＭ；充分混匀并调节酸度值至６．５～８．０，将容器封口，静置１小时后在－４０℃以下冷冻保存。以本方法冷冻保存的红细胞，一年后解冻，红细胞破碎率大于９５％，血红蛋白无变性，未被氧化为高铁血红蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞保存领域，具体地说，涉及。
技术介绍
以无基质血红蛋白为基础的携氧液体，是目前得到广泛关注并极有可能进入临床 应用的一种红细胞替代物。在制备这类携氧液体的一系列流程中，最上游的步骤是采集并 分离、保存红细胞。红细胞的采集与分离技术已经比较成熟，尚待完善的部分是红细胞的 保存。理想的保存用于制备无基质血红蛋白的红细胞的方法应同时满足以下三个方面的 要求(1)红细胞经2 5年甚至更长时间的保存不发生腐败；(2)红细胞中的血红蛋白经 冷冻-解冻过程不变性，不被氧化为高铁血红蛋白；(3)解冻后红细胞即破碎释放出游离血 红蛋白。目前红细胞的保存方式有冷藏、冷冻和冻干，其中冷藏保存红细胞的期限最长为6 周，不能满足长期储存的要求。冻干保存红细胞技术尚不成熟，需要解决的问题主要是相变 过程中的血红蛋白变性。冷冻保存技术是研究时间最长也最成熟的一种保存方法，细胞、蛋 白质、核酸、亚细胞物以至器官、整体动物都有成功冻存的先例，但现有方法皆以保持细胞、 组织、器官结构与功能的完整为目标。在红细胞冷冻保存领域，现有方法也都追求保持红细 胞结构完整、功能完全，解冻后红细胞破碎率低，且约有8 15%的血红蛋白将被氧化为高 铁血红蛋白，不适合冷冻保存用于制备无基质血红蛋白所需的红细胞。因此，迫切需要建立 一种冷冻保存制备无基质血红蛋白所需的红细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，按此方法冷冻保存的红细胞 解冻后即破碎释放出血红蛋白，且血红蛋白经冷冻 解冻过程不变性，不被氧化为高铁血 红蛋白。为实现上述目的，本专利技术提供的冷冻保存红细胞的方法是向红细胞中加入还原 剂和甘油以及乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱 氨酸盐酸盐或N-乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型 谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，加入的还原剂终浓度各为0. 5 300mM;甘油的量以终体积比计为5% 10% ；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为 0. 1 IOmM ；将上述混合液充分混勻并调节酸度值至6. 5 8. 0，将容器封口，静置1小时 后在-40°C以下冷冻保存。上述抗坏血酸或抗坏血酸盐的更优化终浓度为5. 5 115mM，半胱氨酸盐酸盐或 N-乙酰半胱氨酸的更优化终浓度为0. 5 60mM，硼氢化钠的更优化终浓度为2. 5 250mM， 亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠的更优化终浓度为0. 5 50mM，还原型谷胱甘肽的更 优化终浓度为1. 6 130mM。上述乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的更优化终浓度为1 5mM。上述保存红细胞的容器为软袋或硬质容器，使用软袋保存时红细胞体积不超过软袋的标称容量，并排净空气；使用硬质容器时要求红细胞体积与容器容积的比为80% 90%。本方法中甘油浓度经过正交实验优化，使冷冻保存的红细胞解冻后破碎率高的同 时血红蛋白不变性 ’游离Fe3+可导致血红蛋白自氧化，金属离子螯合剂可螯合Fe3+，本方法 中使用乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐螯合游离Fe3+，防止自氧化的发生；添加的还原剂 在降低氧分压的同时，能够保护血红蛋白的四级结构免受红细胞解冻时固-液相的影响， 并能在红细胞破碎后将高铁血红蛋白快速还原。按本方法冷冻保存的红细胞经长期保存 后，解冻时红细胞即破碎释放出血红蛋白，而血红蛋白的活性得到有效保护，可直接进入后 续步骤，因此是一种适合冷冻保存制备无基质血红蛋白所需的红细胞的方法。为检验本方法冷冻保存红细胞的效果，引入的检测指标包括(1)解冻后红细胞 破碎率；(2)解冻后红细胞中血红蛋白一级、三级结构变化情况；(3)解冻后红细胞中血 红蛋白是否被氧化为高铁血红蛋白。解冻后红细胞破碎率的测定通过以下方法进行取 一管冷冻保存的红细胞解冻，平均分配至两个离心管中，其中一管以200W功率超声破碎 10秒X 10次，另外一管不超声破碎；两管皆以200G离心力离心lOmin，取上清液以测定 血红蛋白浓度。红细胞破碎率=未超声破碎管血红蛋白浓度/超声破碎管血红蛋白浓 度X 100%。解冻后血红蛋白一级、三级结构变化情况以聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高效液相 色谱法鉴定。高效液相色谱分析通过装备GF450分子排阻柱(9.6X250mm，6ym粒径，力口 装保护柱)的安捷伦1200液相色谱仪完成，以0. 2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7. 2-7. 4)为流动相，流速lml/min，上样量5 μ l,254nm检测；聚丙烯酰胺凝胶电泳参照《分 子生物学实验指南》(第三版)。解冻前后红细胞中血红蛋白浓度以及高铁血红蛋白含量通 过丹麦雷度公司(Radiometer ltd.)ABL800型血气分析仪测定。以本方法冷冻保存的红细胞经实施例验证，保存一年解冻后红细胞破碎率大于 95 %，血红蛋白无变性，未被氧化为高铁血红蛋白。附图说明图1是以聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析的本专利技术方法保护冻存红细胞中血红蛋白 一级结构效果的电泳图。图2是以高效液相色谱法分析本专利技术方法冷冻保存的红细胞解冻释放并经阴离 子交换层析纯化的血红蛋白的色谱图。图3是以高效液相色谱法分析不经冻存的红细胞低渗破碎释放并经阴离子交换 层析纯化的血红蛋白的色谱图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作详细说明。实施例取180ml洗涤红细胞，加入以下任意一种或者两种或两种以上还原剂的 混合物抗坏血酸(或抗坏血酸盐)、半胱氨酸盐酸盐(或N-乙酰半胱氨酸)、硼氢化钠、 亚硫酸钠(或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠)、还原型谷胱甘肽；所加还原剂的终浓度各为0. 5 300mM。同时还加入终含量以体积比计为5% 10%的甘油以及终浓度为0. 1 IOmM的 乙二胺四乙酸(或乙二胺四乙酸盐)，充分混勻并调节酸度值至6. 5 8.0，将容器封口，静 置1小时后-40°C以下冷冻保存。其中，抗坏血酸或抗坏血酸盐的更优化终浓度为5. 5 115mM，半胱氨酸盐酸盐或 N-乙酰半胱氨酸的更优化终浓度为0. 5 60mM，硼氢化钠的更优化终浓度为2. 5 250mM， 亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠的更优化终浓度为0. 5 50mM，还原型谷胱甘肽的更 优化终浓度为1. 6 130mM。乙二胺四乙酸 或乙二胺四乙酸盐的更优化终浓度为1 5mM。保存红细胞的容器为软袋或硬质容器，使用软袋保存时红细胞体积不超过软袋的 标称容量，并排净空气；使用硬质容器时要求红细胞体积与容器容积的比为80% 90%。根据不同的还原剂组合及用量、不同的甘油用量以及金属离子螯合剂的不同做了 共6个实施例，实施例的具体参数见表1。保存1年后，取9管平行分为3组破碎，进行指 标测定。红细胞破碎率及高铁血红蛋白含量变化情况见表2，测定结果表明，解冻后红细胞 破碎比较完全，破碎率为> 95 %，而血红蛋白不但没有被氧化，高铁血红蛋白含量还有所下 降；甘油含量影响红细胞破碎率，但在本方法的含量范围内其影响并不显著；温度也是影 响破碎率的另一因素，通过实施例发现，冻存温度低时红细胞破碎率较高。图1是以聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析的本专利技术方法保护冻存红细胞中血红蛋白 一级结构效果的电泳图(银染法)，各实施例之间无差异。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冷冻保存红细胞的方法，其特征在于，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；所述还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或Ｎ－乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，所加入的还原剂终浓度各为０．５～３００ｍＭ；所述甘油的量以终体积比计为５％～１０％；所述乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为０．１～１０ｍＭ；将上述混合液充分混匀并调节酸度值至６．５～８．０，将容器封口，静置１小时后在－４０℃以下冷冻保存。

【技术特征摘要】
一种冷冻保存红细胞的方法，其特征在于，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；所述还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或N 乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，所加入的还原剂终浓度各为0.5～300mM；所述甘油的量以终体积比计为5％～10％；所述乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为0.1～10mM；将上述混合液充分混匀并调节酸度值至6.5～8.0，将容器封口，静置1小时后在 40℃以下冷冻保存。2.如权利要求1所述一种冷冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述抗坏血酸或抗坏 血酸盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘良明，臧家涛，徐竞，刘建仓，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]