本发明专利技术公开了一种低毒性的人胚胎干细胞（ｈＥＳＣｓ）玻璃化冻存液。该冻存液由ＤＭＥＭ－Ｆ１２液，ＨＥＰＥＳ缓存液，胎牛血清（ＦＢＳ），乙二醇，异丙醇和蔗糖按一定比例组成。与传统的细胞冻存方法相比，该冻存方法中去除了对细胞毒性较大的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），采用乙二醇和异丙醇按一定比例混合作为渗透性防冻剂，结合蔗糖溶液作为非渗透性保护剂用于低温保存ｈＥＳＣｓ，且复苏率和存活率都达到了较高的水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞的冻存液，具体为一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液。
技术介绍
自从1998年Thomson等首次成功分离得到hESCs系以来，hESCs在未来的再生医 学、发育生物学以及药理学、毒理学等研究领域被寄予众望。hESCs未来的广泛应用意味着 细胞资源需要在不同的实验室之间运输和传递，以促进科学合作；此外就建立hESCs库而 言，需要提供具有不同组织相容抗原分型的种子细胞用于将来的移植替代治疗，以及在不 同阶段保存细胞有利于保证细胞系的稳定和细胞材料能被永久使用，这些目标的实现都需 要建立一种高效的冷冻方式来保存hESCs。目前所广泛使用的传统慢速冻存法保存hESCs 效率较低，多数hESCs解冻后死亡和易于分化。Reubinoff等首次将玻璃化冷冻应用于 hESCs的冷冻，发现其复苏效率明显高于慢速冷冻。因为玻璃化冷冻过程采用急速降温，理 论上> -1500°C /min。一方面最大限度地避免了冰晶形成，另一方面减少了细胞在正常物 理温度下接触低温的时间，降低了冷冻保护液对细胞的毒性。目前国际上的报道，经过玻璃 化冷冻，有大于75%的hESCs克隆能够存活。但是有一个问题就是在hESCs玻璃化冷冻过 程中使用的冷冻保护剂DMSO对细胞的毒性较大。DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细 胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢 产物的通透性。但是研究表明，DMSO存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导 致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，因此在hESCs运用于临床的过程中，应避免引入 DMSO的潜在影响。
技术实现思路
本专利技术将探讨用一种毒性较低的冷冻保护剂对DMSO进行替代，对hESCs进行玻璃 化冻存，并取得与之相等甚至更好的冷冻复苏效果。本专利技术提供的hESCs玻璃化冻存液是由下列组分组成的其由三种分开保存的混 合液组成，各混合液按体积百分比计的组成如下平衡缓冲液20%FBS+2% IM HEPES+78% DMEM-F12 ；玻璃化冻存液I 10%乙二醇+10%异丙醇+80%平衡缓冲液；玻璃化冻存液II 20%乙二醇+20%异丙醇+30% IM蔗糖溶液+30%平衡缓冲液。使用时将hESCs用平衡缓冲液平衡5-10分钟；加入玻璃化冻存液I 1分钟；再加 入玻璃化冻存液II 25秒，最后直接投入液氮内保存。该玻璃化冻存方法用到的冻存液去除了对细胞毒性较大的DMS0，采用乙二醇和异 丙醇按一定比例混合作为渗透性防冻剂，结合蔗糖溶液作为非渗透性保护剂用于低温保存 hESCs，复苏后存活率达到86. 67士 15. 28%，且91. 53士7. 50%的hESCs仍然保持了未分化特征。DMEM-F12, ^Bnn^ii^o Dulbecco' s Modified Eagle Medium =Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)中的 KNOCKOUT DMEM-F12 (货号 12660-012)附图说明中的基因和抗原名称的中文意思对应翻译如下Hepes :4_羟乙基哌嗪乙磺酸；0CT-4 一种干细胞转录因子，核内抗原；SSEA-3 阶段特异性胚胎抗原_3 ；TRA-1-60 肿瘤排斥抗原_1_60SSEA-4 阶段特异性胚胎抗原_3 ；TRA-1-81 肿瘤排斥抗原_1_81S0X-2、NANOG、REX-I —种干细胞转录因子编码基因；TDGFl 畸胎癌来源的生长因子1 ；TERFl 端粒相关因子1FGF4 成纤维细胞生长因子4 ；LEFTYA =TGF-β家族的基因THY-I —种抑癌基因，又名CD90 ；DPPA2 发育多能性相关因子2 上述物质都是可商业化得到的。附图说明图1复苏后hESCs的形态学和细胞免疫细胞化学染色结果。A复苏后细胞在形态 上保持了未分化外观克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比。复苏后克隆为0ct-4(B)， SSEA-3 (C)，SSEA-4 (D)，TRA-1-60 (E)，TRA-1-81 (F)阳性克隆；图2运用本专利技术冻存hESCs，复苏后表达了多能性基因Oct-4，S0X-2，Nanog, Rex 1， TDGFl，TERFl，Thy-I，LEFTYA，FGF4 和 DPPA2 ；具体实施例方式方法和步骤1、配液1).平衡缓冲液15.6ml DMEM-F124. Oml FBS0. 4ml IM HEPES2). IM蔗糖溶液3. 42g 蔗糖8. Oml 平衡缓冲液37°C溶解后，用0. 22um规格的过滤器过滤，4°C保存备用，或_20°C长期保存。3).玻璃化冻存液I800ul 平衡缓冲液IOOul 乙二醇IOOul 异丙醇4).玻璃化冻存液II300ul 平衡缓冲液300ul IM 蔗糖溶液200ul 乙二醇200ul 异丙醇5).复苏液I (0. 2M蔗糖溶液)800ul 平衡缓冲液200ul IM 蔗糖溶液6) ·复苏液11 (0. IM蔗糖溶液)900ul 平衡缓冲液IOOul IM 蔗糖溶液2、细胞准备1)用 Rock inhibitor 处理 hESCs 1 小时。2)将hESCs克隆用Iml注射器切成10个约ImmXlmm大小的团块，用TIP头轻轻铲 起使之悬浮。3、冷冻将10个hESCs团块放入平衡缓冲液中平衡5-10分钟；玻璃化冻存液I 1分钟；玻 璃化冻存液II 25秒，最后利用毛细作用吸入冻存麦管中，直接投入液氮内。4、复苏将冻存麦管从液氮中取出，并迅速将其中的hESCs团块传入复苏液I 1分钟；复苏 液II 5分钟；平衡缓冲液5分钟；再传入另一平衡缓冲液中5分钟，最后将细胞团块种入 hESCs的基础培养基中。5、结果统计免疫细胞化学染色结果显示为Oct-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81阳性 (图 IB, 1C, ID, IE, 1F)，表达了多能性基因 Oct-4, Sox-2, Nanog, Rexl, TDGFl, TERFl, Thy-I, LEFTYA，FGF4和DPPA2(图2)，在形态上保持了未分化外观克隆内细胞排列紧密，细胞维持 高核质比(图1A)。本实施例重复了 3次，结果统计如下复苏百分率96.67士5. 77存活百分率86.67士 15. 28未分化百分率91. 53士7. 50。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液，其特征在于其由三种分开保存的混合液组成，各混合液按体积百分比计的组成如下：平衡缓冲液：２０％ＦＢＳ＋２％１ＭＨＥＰＥＳ＋７８％ＤＭＥＭ－Ｆ１２；玻璃化冻存液Ⅰ：１０％乙二醇＋１０％异丙醇＋８０％平衡缓冲液；玻璃化冻存液Ⅱ：２０％乙二醇＋２０％异丙醇＋３０％１Ｍ蔗糖溶液＋３０％平衡缓冲液。
【技术特征摘要】
一种低毒性的人胚胎干细胞玻璃化冻存液，其特征在于其由三种分开保存的混合液组成，各混合液按体积百分比计的组成如下平衡缓冲液20％FBS+2％1M HEPES+78％DMEM F12；玻璃化冻存液I10％乙二醇+10％异丙醇+80％平衡缓冲液；玻璃化冻存液II...
【专利技术属性】
技术研发人员：林戈，卢光琇，欧阳琦，
申请(专利权)人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：43
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