卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法技术

本发明专利技术涉及一种卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法。虽然玻璃化冷冻法已广泛应用于实验动物中，但目前还没有一个通用的冷冻方法和标准的冷冻液配置方案，导致玻璃化冻存的体积移植徘徊在小体积阶段，而卵巢小皮质片所含卵泡有限，影响移植卵泡的寿命。本发明专利技术提供了适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，在常用玻璃化液的基础上添加了促性腺激素，本发明专利技术进一步提供了适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，特别是玻璃化冻存不同体积卵巢大皮质片的最适宜的渗透平衡时间，方便实验动物、良种大家畜、突然死亡的野生濒危物种卵巢的冻存；采用此方法能够提高卵泡存活，缩短移植物的血流再灌注的时间，提高冻存卵巢移植回体内的存活率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞、组织和器官的超低温保存的
，具体涉及ー种。
技术介绍
玻璃化冷冻是1985年由Rall和Fahy首先提出来的超快速超低温保存的新技术，不仅操作方法简便，而且冻存效果好，可较好保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性，具有经济、简便和高效的优点，是近年低温生物学领域发展最快的研究方向之一。将癌症患者卵巣在癌症放化疗前进行冻存，癌症控制后，将冻存卵巣移植回体内，在一定程度上恢复患者卵巣的内分泌功能和生育能力。近年许多学者相继报道了小鼠、大鼠、羊、猴及人的卵巢组织玻璃化冷冻成功(參见文献Kagabu S Umezu M.Transplantation of しryopreserved mouse, Chinese hamster, rabbit, Japanesemonkey and rat ovaries into rat recipients [J]. Exp Anim，2000，49 (I):17-21.Alaghbari AM，Jr Menino AR. Survival of oocytes recovered from vitrifiedsheep ovarian tissues[J]. Annimal Reprod Science, 2002，71(1-2) :101-110.Lee KA，Lee SH，Yoon SJ，et al. Resumption of the human primordial folliclegrowth in xenografts after vitrification of the ovarian tissue [J].FertilSteril,2000, 74(3) :S214.)。虽然玻璃化冷冻法已广泛应用于实验动物中，但目前还没有ー个通用的冷冻方法和标准的冷冻液配置方案，导致玻璃化冻存的体积移植徘徊在小体积阶段。但由于卵巢小皮质片(ImmX2mmX2mm)所含卵泡有限，移植回体内后由于卵泡的消耗使生理性生殖内分泌状态维持时间较短(2 3年)，同时，切割时会因卵泡破坏过多造成卵泡数量的減少。大皮质片(80mm3以上)移植因含原始卵泡数量巨大，将明显延长移植物的功能寿命，目前，最大的皮质块面积为15mmX5mm,厚度均为l_2mm大小，且均采用低浓度保护剂的慢速冻存法(參见文献J Donnez,丽Dolmans, D Demylle, PJadoul, C Pirard, J Squifflet, B Martinez—Maarid, and A vanLangenaonckt. Livebirthafter orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue..2004,.Lancet, Oct 2004;364(9443) :1405-10 ；Dror Meirow,Jacob Levron, Talia Eldar-Geva etal. Pregnancy after Transplantation of Cryopreserved Ovarian Tissue in a Patientwith Ovarian Failure after Chemotherapy. N Engl J Med2005; 353; 318-321.),慢速冷冻法是采用冷冻降温仪按设置的程序进行冷冻，冷冻过程时间长，消耗液氮多，而且需要专门的仪器，一般实验室不易实施。卵巢大皮质片的玻璃化冷冻是近期研究者关注的焦点和难点，具体操作方法面临如下挑战组织块太大将使皮质片在玻璃化液中的渗透时间延长，虽然可提供足够的时间使得保护剂进入中央区域，但边缘区域就将暴露于高浓度保护剂中的时间过长，会产生细胞毒性损伤。若滲透时间较短，则造成皮质片中心的冷冻保护剂不能达到有效浓度。因此如何在最大限度地降低细胞毒性的条件下，保证中央区域保护剂的渗入是确保卵巣大皮质片玻璃化冷冻成功的关键。目前尚无适用于卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及其冷冻方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，本专利技术的另ー目的是提供ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法。本专利技术所要解决的技术问题主要是大皮质片的冻存由于保护液的渗入和透出时间长，经受的低温保护剂的毒性时间也长，可能面临更大的毒性损伤。同时，大皮质片无血管吻合移植将由于血流不能及时到达而面临缺血缺氧损伤，会损失卵母细胞和女性激素产生的基础——原始卵泡。因此，要解决以上技术问题，首先必须要有一种既能抵抗冻存过程中产生的凋亡又可促进冷冻后移植卵巣快速回复血流的玻璃化冷冻保护液。 本专利技术提供了ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冻存保护液，该玻璃化冻存保护液是将促性腺激素作为抗凋亡剂加入到冻存使用液体中，所用的玻璃化冷冻保护液为EG5. 5/30液，此保护液由5. 5mol/Lこニ醇(EG)+30%聚鹿糖+0. 5mol/L鹿糖组成,在此基础上添加了促性腺激素(gonadotropins)。所述的促性腺激素，可以是人绝经期促性腺激素(HMG)、黄体生成素(LH)或促卵泡刺激激素(FSH)。优选促卵泡刺激激素(FSH)。成年小鼠卵巢器官大皮质片的玻璃化冷冻保护液玻璃化液EG5. 5/30 (5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加0. 2IU/mL 0. 6IU/mL FSH、LH或人绝经期促性腺激素(HMG)，最佳地浓度为0. 3IU/mLFSH。绵羊卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液玻璃化液EG5. 5/30(5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加5 u g/mL 20 y g/mL的促卵泡成熟激素(FSH)，最佳地为10 u g/mL的FSH。本专利技术提供的适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，不仅可以抵抗卵巢组织在冻存中产生的凋亡，而且促进移植后血流的在灌注时间提前12-24h。利用该玻璃化冷冻保护液对成年小鼠卵巣器官、绵羊大皮质片的玻璃化冻存，冻存效果好，可较好保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性，并且冻存卵巢大皮质片移植回体内，内分泌功能、生育功能等活性未受到影响。使用本专利技术的玻璃化冷冻保护液，冻存卵巢大皮质片，卵巢大皮质片的体积为80mm3 以上，一般在 80mm3-200mm3 之间，厚度< 2mm。本专利技术还提供了ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，该玻璃化冷冻方法主要涉及卵巣大皮质片体积玻璃化冻存渗透平衡最佳时间控制技木。进ー步地，本专利技术摸索出根据卵巢大皮质片的冷冻组织面积大小来确定其在玻璃化冷冻保护液中滲透平衡时间的规律，方便大皮质片卵巢组织的玻璃化冷冻时间的掌握并保证了冻存效果。本专利技术人将2 6月龄的绵羊卵巢皮质样本按体积分为小样(40mm3=5mmX 4mmX 2mm)、中样(80mm3=IOmm X 4mm X 2mm)、大样(160mm3=10mmX 8mmX 2mm)，采用两步渗透平衡法进行玻璃化冻存，全过程在室温(22 24°C)下进行。I.预渗透平衡I. 5mol/Lこニ醇(EG)+20%小牛血清(ICS)，小样15min、中样20mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，在5.5mol/L乙二醇+30%聚蔗糖+0.5mol/L蔗糖的玻璃化液中添加促性腺激素，所述的卵巢大皮质片体积为80mm3以上，厚度≤2mm。

【技术特征摘要】
1.ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，在5. 5mol/Lこニ醇+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖的玻璃化液中添加促性腺激素，所述的卵巢大皮质片体积为80mm3以上，厚度 < 2_。2.根据权利要求I所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的促性腺激素是人绝经期促性腺激素、黄体生成素或促卵泡刺激激素。3.根据权利要求I或2所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的卵巢大皮质片是成年小鼠卵巢大皮质片，所述的促性腺激素是0. 2IU/mL 0.6IU/mL的人绝经期促性腺激素、黄体生成素或促卵泡刺激激素。4.根据权利要求3所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的促性腺激素是0....

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕蓉，党玲，王红燕，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：