本发明专利技术是一种日本蟳精子冷冻保存方法，其特征在于，它包括取材、精子活力鉴定、降温平衡、第一次预冷、第二次预冷和冻存等步骤。本发明专利技术是针对日本蟳精子的生物学特点，筛选出适合日本蟳精子的冷冻保存方法，可以长期有效地保存日本蟳精子。利用本发明专利技术将日本蟳精子在液氮中保存一年后，解冻后的精子存活率可达７０％以上。本方法无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，效果好，为日本蟳的人工授精工作提供了精子来源保障，并可用于日本蟳的杂交育种、种质优选、雌核发育及物种保护等其他研究领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种动物精子的保存方法，特别是一种日本蟮精子冷冻保存方法。
技术介绍
在水产增养殖生产中，随着人工授精技术的发展和种质资源保护的需要，精子体 外保存技术研究越来越受到关注。精子的长期保存，可以保证基因长时间的稳定性，同时也 避免了饲养亲本所需的花费，大大提高了选育的可行性，也为精子代谢及生理研究提供了 技术平台。 日本蟮Charybdis japonica肉味鲜美、营养丰富、价格适中，市场需求量不断增 加。由于过度捕捞导致日本蟮的天然资源量锐减，已远远不能满足人类的需求，因此亟待开 展日本蟮的人工增养殖。在日本蟮人工繁殖生产中，如何提高亲蟹交配成功率是一个主要 问题。 在目前已公开的有关动物精子保存的专利中，多数是针对哺乳动物(牛、山羊、) 的精子保存技术，有少数涉及到水生经济动物的精子保存。现有技术中公开的水生经济动 物的精子保存方法主要为鲤科鱼类(青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)、中华鲟等鲟科鱼类 和主要海水鱼类(舻鱼、大菱鉀、大黄鱼、牙鉀、圆斑星鲽和石鲽等)的精子保存方法，迄今 尚无关于蟹类精子保存技术的专利。日本蟮(Charybdis japonica A. Milne-Edwards)隶 属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科，由于不同种类动物的精子具有不同的生物学 特性，所以现有技术中公开的精子保存方法不适宜用于日本蟮精子的保存。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法简单、可操作性强的针对日本蟮精子的生物学特点筛选出适合日本蟮精子的冷冻保存方法，以用于日本蟮的人工繁殖生产，并为日本蟮的种质资源保存、杂交育种等研究提供技术平台。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种日本蟮精子冷冻保存方法，其特点是，其步骤如下 (1)取材在3月中旬至8月下旬，取精巢发育成熟期的日本蟮雄体，解剖，取出 精巢放入研钵中，加入适量无钙人工海水研磨3-5分钟后，用200目筛绢网过滤去除组织 碎片，1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，用稀释剂稀释至106个/ml的精子悬 浮液，4t:保存备用；所述的无钙人工海水的配制方法为NaCl 21.63g， NaOH 0. 19g， KC1 1. 12g，MgS04 *7H20 4. 93g，H萬0. 53g，溶于1L蒸馏水中即得；所述的稀释剂制法为NaCl 25. 0g，Na2S04 3. 9g， KC1 0. 73g， MgCl2 6H20 10. 7g， NaHC03 0.23g，溶于1L蒸馏水中，调整 pH至8. 0，并加入青链霉素使青链霉素终浓度达到200U/mL ; (2)精子活力鉴定用滴管取一滴精子悬液于载玻片上，制成涂片；用2X曙红B 染色4min后，置于显微镜下观察，随机计数至少200个精子，计算精子活率；鉴别日本蟮精 子的死活方法为活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色；当计算所得日本蟮精子活率达到85%以上时，进行下述冷冻步骤； (3)降温平衡将精子悬浮液加入抗冻剂15%二甲基亚砜DMS0-V/V分装至l_2ml 冻存管中，于4t:冰箱中降温平衡30min ; (4)第一次预冷在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮 表面距离冻存管支架表面5cm ;将降温平衡处理过的冻存管用纱布包裹后平放于冻存管支 架上，盖上保温瓶盖，预冷25min ; (5)第二次预冷打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮表面距离冻存管支 架表面l-5mm，盖上保温瓶盖，预冷5min ; 冻存取出冻存管，分组装入带长线绳的纱布袋中，然后将其置于液氮罐中保存；长线绳端部露出液氮罐外，并贴上用于标注的标签。 当需要使用所保存的精子标本时，可以按以下方法进行解冻打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的长线绳，将装有冻存管的纱布袋拎出，迅速放入4(TC水浴中解冻并检测活力后使用。 以下对本专利技术相关试验进行详细的阐述。 l材料与方法 1. 1材料 鲜活雄性日本蟮于2007年4月5日 5月20日购自连云港市新浦区直销农贸市 场，共40只，体重为(120. 7±18. 5)g，平均甲长为(8. 2±2. 4)cm，平均甲宽为(5. 3±1.5) cm。解剖，打开背甲，取出精巢放入研钵中。加入少量无钙离子人工海水(配制方法 NaCl 21. 63g， NaOH 0. 19g， KC1 1. 12g， MgS04 7H20 4. 93g， H3B03 0. 53g，加蒸馏水定容至 lOOOmL)，研磨5分钟后，用200目筛绢网过滤以去除组织碎片。1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，4t:保存备用。 1.2方法 1. 2. 1精子存活率的检测方法 (1)检测日本蟮精子活力染色方法的筛选。染色剂为用过滤海水配制的曙红B和 台盼蓝染色液，浓度设置为0. 25%、1%、2%、4%四个梯度，染色时间设置为2min、4min、 8min、12min四个梯度，筛选出适用于评价日本蟮精子活力的染色剂及染色方法。 (2)精子存活率评价。每次随机计数200个精子，分4个随机计数点，每个点约计 50个精子，统计样品的精子存活率。各实验均重复3次，实验数据用"平均数+标准差"表 示。采用SPSS16. O软件进行数据处理，并进行单因子方差分析(Oneiay ANOVA) ， LSD (Least Significant Difference)多重比较和Duncan检验。 1. 2. 2pH对精子活力的影响 以上述无f丐离子人工海水作为基础培养液，用0. lmol/L的NaoH和HC1溶液调节 pH至5、6、7、8、9、10、ll共7个pH梯度，依次为实验1_7组。取1. 1精子沉淀，测初始活力 后于各实验组中，用枪头吹打散开，15t:保存(因日本蟮交配产卵盛期在5月中旬至6月下 旬，此期间水温变化范围在15.0 26. 5t:，本实验取下限低温值)，并分别于lh，4h，24h， 48h，72h时测定精子存活率。 1. 2. 3盐度对精子活力的影响 用NaCl和蒸馏水配制15， 20， 25， 30， 35， 40， 45共7个盐度梯度，依次为实验1-74组，各组pH均调节至8.0。取精子沉淀于各实验组中，用枪头吹打散开，15t:保存，并分别于lh， 4h， 24h， 48h， 72h时测定精子存活率。 1. 2. 4精子保存密度对精子活力的影响 取精子沉淀，分别用无钙离子人工海水调节密度至104， 105， 106， 107， 108， 109， 101Q 个/mL共7个梯度，用枪头吹打散开，15t:保存，并分别于lh，4h，24h，48h，72h时测定精子 存活率。 1. 2. 5不同稀释剂对精子冷冻保存的影响 稀释剂采用下列7种，配方是在参考有关文献中应用于鱼类、虾类、贝类等精子稀 释剂的基础上，针对日本蟮精子的生物学特点修改而成的。各稀释剂的pH均调节至8. O，并 加入10% DMSO和青链霉素(终浓度达到200U/mL)。 稀释剂I :上述无钙离子人工海水； 稀释剂II :NaCl 25. Og， Na2S04 3. 9g， KC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种日本蟳精子冷冻保存方法，其特征在于，其步骤如下： （１）取材：在３月中旬至８月下旬，取精巢发育成熟期的日本蟳雄体，解剖，取出精巢放入研钵中，加入适量无钙人工海水研磨３－５分钟后，用２００目筛绢网过滤去除组织碎片，１０００转／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取得白色精子沉淀，用稀释剂稀释至１０↑［６］个／ｍｌ的精子悬浮液，４℃保存备用；所述的无钙人工海水的配制方法为：ＮａＣｌ ２１．６３ｇ，ＮａＯＨ ０．１９ｇ，ＫＣｌ １．１２ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ ４．９３ｇ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］ ０．５３ｇ，溶于１Ｌ蒸馏水中即得；所述的稀释剂制法为：ＮａＣｌ ２５．０ｇ，Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］３．９ｇ，ＫＣｌ ０．７３ｇ，ＭｇＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ １０．７ｇ，ＮａＨＣＯ↓［３］０．２３ｇ，溶于１Ｌ蒸馏水中，调整ｐＨ至８．０，并加入青链霉素使青链霉素终浓度达到２００Ｕ／ｍＬ； （２）精子活力鉴定：用滴管取一滴精子悬液于载玻片上，制成涂片；用２％曙红Ｂ染色４ｍｉｎ后，置于显微镜下观察，随机计数至少２００个精子，计算精子活率；鉴别日本蟳精子的死活方法为：活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色；当计算所得日本蟳精子活率达到８５％以上时，进行下述冷冻步骤； （３）降温平衡：将精子悬浮液加入抗冻剂１５％二甲基亚砜ＤＭＳＯ－Ｖ／Ｖ分装至１－２ｍｌ冻存管中，于４℃冰箱中降温平衡３０ｍｉｎ； （４）第一次预冷：在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面５ｃｍ；将降温平衡处理过的冻存管用纱布包裹后平放于冻存管支架上，盖上保温瓶盖，预冷２５ｍｉｎ； （５）第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面１－５ｍｍ，盖上保温瓶盖，预冷５ｍｉｎ； （６）冻存：取出冻存管，分组装入带长线绳的纱布袋中，然后将其置于液氮罐中保存；长线绳端部露出液氮罐外，并贴上用于标注的标签。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许星鸿，阎斌伦，徐加涛，徐国成，浦寅芳，许建和，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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