一种矮马精液冷冻保存的方法技术

本发明专利技术公开了一种矮马精液冷冻保存的方法，将矮马精液与特别研制的冷冻保存稀释液混合后，进行程序化降温，最后保存于液氮中。本发明专利技术的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，将矮马精液与特别研制的冷冻保存稀释液混合后，进行程序化降温，最后保存于液氮中。本专利技术的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。【专利说明】
本专利技术属于生物
，涉及一种动物精液保存的方法，尤其涉及。
技术介绍
精液冷冻保存是利用超低温抑制精子细胞的代谢活动，使之处于几乎静止的状态，进行长期保存，解冻后又能回复到正常生理状态。精液冷冻解冻后结合人工授精技术能充分扩大优秀种公畜的利用率，加快品种改良进程和快速扩繁良种畜禽。精液冷冻保存方法的完善对现代畜牧业发展起着非常重要促进作用。动物精液冷冻保存
研究的历史悠久，已经开发出许多种动物的精液冷冻保存方法，但不同物种的保存方法存在差异。关于马的精液冷冻保存，国外已经有数十种马精液冷冻稀释液配方的文献报道，国内新疆农业大学、新疆畜牧科学院畜牧研究所、塔里木大学等开展了马精液的冷冻保存方面的研究。现有的马精液的冷冻保存液和冷冻方法仍然不够成熟，主要通过液氮熏蒸进行冷冻，降温速度不能很好地控制，剧烈降温可能会导致精子损伤甚至死亡，冷冻精子质量差，复苏率低，冷冻效果不稳定，难以规模化推广应用。矮马指成年体高在106厘米以下的马，英文中称之为pony (与专指大马的horse相对应)。因其小巧玲珑、天资聪颖、性情温顺而深受人们的喜爱。可用于观赏、娱乐、实验和劳役，也是小朋友和老年人很好的“朋友”。因为数量稀少，更显得尤为珍贵，可以说是马中之宝。从文献检索来看，目前还没有涉及矮马精液冷冻保存方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于·针对上述技术问题，提供一种可以有效提高矮马精液冷冻保存的质量和效果的矮马精液冷冻保存的方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是:—种矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用；(2)制备冷冻保存稀释液，每IOOmL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4~3.8g、乳糖7.0~7.4g、柠檬酸钠0.2~0.6g、上层卵黄4.8~5.2mL、二甲基酰胺4.8~5.2mL、维生素E0.04~0.08g、青霉素8~12万单位、链霉素8~12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25~35min，再用孔径0.3~0.5 μ m的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。(3)采集矮马精液后，过滤去除胶状物质，经离心后除去上层精清；(4)按精液、冷冻保存稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀；(5)将稀释后的矮马精液分装至细管中封口，使用程序降温仪进行程序化降温，降温程序为:预设20°C启动程序，缓慢降温至5°C停留5min，快速降温至-10°C停留2min，随后快速降温，当温度降至_43°C后，快速取出细管转入液氮中保存。优选地，步骤(1)中，鸡蛋的卵黄离心时的转速为10000r/m，离心时间为30min。优选地，步骤(2)中，每IOOmL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖36g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；制备时制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌30min，再用孔径0.4 μ m的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。优选地，步骤(3)中，采集矮马精液后，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，离心时的转速为1200r/min,离心时间为7min。优选地，步骤(4)中，冷冻保存稀释液需先预热到37°C。优选地，步骤(5)中，稀释后的矮马精液先在25°C静置lh，再分装至细管中封口。通过以上技术方案，本专利技术的有益效果如下:本专利技术使用的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例1.配制冷冻保存稀释液(I)用75%的酒精擦拭消毒鸡蛋壳，待酒精挥发干后，敲破蛋壳，去除蛋清后把完整的卵黄倒在无菌滤纸上，用干净的滤纸把残余的蛋清吸干，用不带针头的一次性注射器刺破卵黄膜，吸取卵黄。把卵黄装入IOml离心管中，10000r/m高速离心30分钟，吸取中上层卵黄备用；(2)配制冷冻保存稀释液，每IOOmL矮马精液冷冻保存稀释液中，各组分的含量为:葡萄糖3.6g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；配制方法:将上述除上层卵黄以外的组分先溶解于适量的无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，然后用磁力搅拌器搅拌稀释液30min，再用孔径0.4 μ m的滤器过滤，制成冷冻基础稀释液。2.矮马精液的冷冻保存(I)采精前30min左右，将精液冷冻保存稀释液置于37°C水浴中预热。(2)采用假阴道法收集矮马精液，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，然后分装入离心管中，1200r/min离心7min，去除上层精清。活力即直线运动精子比例达到70%以上，可以冷冻；其中，所述矮马为德保矮马。(3)按精液、稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液沿容器壁缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀。(4)将稀释后的精液混合溶液置于室温(25°C)中静置I小时后，分装于0.5mL细管中封口。(5)将程序降温仪提前工作预冷至程序设定设定的起始温度，将装有精液的细管插入降温仪的冷冻槽，进行程序化降温冷冻，降温程序为:预设20°C启动程序，缓慢降温至5°C停留5min，快速降温至_10°C停留2min，随后快速降温，当温度降至_43°C后，快速取出细管转入液氮中保存。所述程序降温仪的型号为CL5500，产地澳大利亚。试验例I冻精用于人工授精试验将按实施例所得的德保矮马冻精解冻后，采用直肠把握法输精入发情母马的子宫体深部。试验人工授精发情母马16匹，3月后妊娠检查确定7匹母马怀孕。试验例2冻保存稀释液的研制(I)按表1中5种配方分别配制精液冷冻保存基础稀释液，冷冻保存德保矮马精液，并对解冻后的精子活力和精子运动速度(平均直线速度VSL、平均曲线速度VCL、平均路径速度VAP)进行评价，确定较优基础稀释液配方。表1矮马精液冷冻保存基础稀释液配方【权利要求】1.，其特征在于，包括以下步骤: (1)将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用； (2)制备冷冻保存稀释液，每IOOmL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4~3.8g、乳糖7.0~7.4g、柠檬酸钠0.2~0.6g、上层卵黄4.8~5.2mL、二甲基酰胺4.8~5.2mL、维生素E0.04~0.08g、青霉素8~12万单位、链霉素8~12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25~35mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用；（2）制备冷冻保存稀释液，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4～3.8g、乳糖7.0～7.4g、柠檬酸钠0.2～0.6g、上层卵黄4.8～5.2mL、二甲基酰胺4.8～5.2mL、维生素E0.04～0.08g、青霉素8～12万单位、链霉素8～12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25～35min，再用孔径0.3～0.5μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。（3）采集矮马精液后，过滤去除胶状物质，经离心后除去上层精清；（4）按精液、冷冻保存稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀；（5）将稀释后的矮马精液分装至细管中封口，使用程序降温仪进行程序化降温，降温程序为：预设20℃启动程序，缓慢降温至5℃停留5min，快速降温至?10℃停留2min，随后快速降温，当温度降至?43℃后，快速取出细管转入液氮中保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋钦杨，郑自华，韦英明，陈宝剑，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：