本发明专利技术提供了一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法，该保存液为超纯水配制的溶液，该溶液中包含如下浓度范围的组分：十二水磷酸氢二钠１５－２５ｍｍｏｌ／Ｌ，二水磷酸二氢钠１－１０ｍｍｏｌ／Ｌ，一水枸橼酸钾４－６ｍｍｏｌ／Ｌ，氯化钠１０－３０ｍｍｏｌ／Ｌ，六水氯化镁５－１０ｍｍｏｌ／Ｌ，三磷酸腺苷二钠３－１０ｍｍｏｌ／Ｌ，还原性谷胱甘肽１－５ｍｍｏｌ／Ｌ，α－硫辛酸０．１－０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，海藻糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ５）１００－１５０ｍｍｏｌ／Ｌ，羟乙基淀粉２００／０．５１０－５０ｇ／Ｌ，苦参碱２－１０ｍｇ／Ｌ；其制备方法包括如下步骤：按照所述组分的浓度要求将所述各组分准确称量，其中的α－硫辛酸避光称量；用适量超纯水完全溶解除α－硫辛酸外的其他组分；在避光状态下充分溶解α－硫辛酸；加超纯水至足量。本发明专利技术的保存液可以在低温状态下很好保护生物人工肝用肝细胞的细胞活力及肝细胞特有功能，以满足生物人工肝用大规模肝细胞库的短期低温保存及或远距离运输过程中肝细胞的保护。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人体或动物的器官、组织或细胞的体外保存液生物
，尤其是 涉及。
技术介绍
我国是肝病的高发区，每年发生急性病毒性肝炎约120万例，重型肝炎约占其中 的0. 2% 0. 4%，病死率可高达70%。乙肝患者中约有1 %可发展为急性或亚急性肝衰竭。 约有20%急性乙肝患者可转化为慢性，约3%患者可发展为肝炎后肝硬化。丙肝患者中约 60% 80%转化为慢性，20%可发展为肝硬化，12%发展为终末期肝病。每年死于肝病者约 30万例，其中50%为原发性肝细胞癌，大多与乙、丙型肝炎有关。因此重型肝炎、肝衰竭以 及肝炎终末期肝病肝硬化和肝癌等是我国肝病患者死亡的主要原因。肝移植是治疗此类疾 病的最彻底与有效的方法。我国的肝移植数每年在700例以上，1年生存率超过50%，最长 存活时间超过6年。但是我国重型肝炎患者多供器官缺乏，许多患者得不到及时的肝移植 手术而丧失存活机会，同时有效的供体资源也未能充分利用。因此生物人工肝与肝细胞移 植等细胞水平的新治疗方法得到了研究与发展。肝细胞移植和生物人工肝支持在大量动物 实验和一些临床实验中获得良好效果，成为有前途的肝病治疗途径。实际上，如果肝细胞移 植及生物人工肝在临床的大量运用，肝细胞的需求量必将增加，同器官移植一样面对的供 者不足的情况也将要出现。若有一实用可靠的低温储存技术，建立一个肝细胞库，危重患者 随时都能得到大量高活率、有功能的肝细胞；肝细胞移植和生物人工肝技术就能普遍推广。生物人工肝支持系统中最重要的部件就是生物反应器。然而生物反应器的合成需 要一个有丰富经验的团队在无菌条件下用特殊设备进行细胞的扩增及功能的标准化检测， 这就需要一个中心一 “细胞工厂”去提供生物反应器装载细胞的扩增及运送到有需要的医 院。猪肝细胞作为生物反应器装载细胞经深低温冻存_复苏后细胞存活率及肝细胞特有功 能均明显下降，大大限制了人工肝的治疗效果。因此，肝细胞扩增完成后，在短时间保存及 长距离运输过程中需要有一种方便、有效、实用的保护装载细胞活力及功能的方法。4°C是 器官及大规模细胞群的标准保存温度，在此温度下运输无须特殊设备即可达到要求。在4°C 保存过程中肝细胞损伤主要是低温损伤及复温再损伤，类似于器官移植过程中的缺血再灌 注损伤。Belzer等根据低温下器官的各种病理生理特点，提出了一种有效的器官低温保护 液的成分，必须具备以下五个方面的特点①减少因低温导致的细胞水肿②防止细胞的酸 化作用③防止灌洗过程中的细胞间隙的肿胀④防止氧自由基的损伤，尤其在再灌注过程中 ⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持细胞内环境稳定。目前市场上主要的器官保护液主要有美国设计的UW液和欧洲设计的HTK液。UW 液是目前世界范围内应用最为广泛的一种多器官灌注保存液，能够有效地保存肾脏72h、胰 腺72h、肝脏30h、心脏24h，但是它仍然有许多不足，它的高渗性引起细胞皱缩、高粘滞性影 响原位灌注、高钾不符合生理、缺乏保护肝脏低温保存的药物、价格昂贵。HTK液与UW液一 样是较理想的的器官保存液，HTK液最大的优点在于它的低粘滞性，可改善保存器官的微循环，提高组织氧化等，它仍有明显的不足主要体现在器官保存时间的限制上，随着时间的延 长移植物无功能的发生率会大幅度提升。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供了一种生物人工肝用肝细胞的保 存液及其制备方法，此保存液可以在低温状态下很好保护生物人工肝用肝细胞的细胞活力 及肝细胞特有功能，以满足生物人工肝用大规模肝细胞库的短期低温保存及或远距离运输 过程中肝细胞的保护。本专利技术提供了一种生物人工肝用肝细胞的保存液，为超纯水配制的溶液，该溶液 中包含如下浓度范围的组分十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸橼酸钾(C6H5K3O7 · H2O) 氯化钠(NaCl) 六水氯化镁(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二钠(CltlH14N5Na2O13P3) 还原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2) 海藻糖(C6H12O5) 羟乙基淀粉200/0. 5 苦参碱该溶液的PH为7. 2-7. 4，渗透压为305士 10mmol/L。 优选地，所述溶液中包含如下浓度的组分 十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸橼酸钾(C6H5K3O7 · H2O) 氯化钠(NaCl) 六水氯化镁(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二钠(CltlH14N5Na2O13P3) 还原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2)15-25mmol/L1-10mmol/L 4-6mmol/L10-30mmol/L 5-1Ommo1/L 3-1Ommo1/L l-5mmol/L 0. l-o. 5mmol/L 100-150mmol/L 10-50g/L2-10mg/L7163mg/L 780mg/L 1622mg/L 1168mg/L 1827mg/L 2755mg/L 922mg/L 41mg/L47287. 5mg/L 30g/L 6mg/L海藻糖(C6H12O5) 羟乙基淀粉200/0. 5 苦参碱本专利技术的生物人工肝用肝细胞的保存液配制方法为按照上述配方将药物用电子 天平精确称量，用适量超纯水完全溶解除α-硫辛酸外的其他成分，避光精确称量α-硫辛 酸后，在避光状态下充分溶解，加超纯水至足量，4°C条件下测定PH值、渗透压，真空过滤器 (0. 22 μ m)过滤，抽取样本做细菌培养，将液体装入棕色PVP袋，置4°C冰箱保存备用，所得 液体呈无色透明、无混浊、无沉淀及絮状物。上述操作过程均在无菌配制室完成，所用器具均经过无菌处理。本专利技术生物人工肝用肝细胞的保存液含有的基本组分是能够维持低温状态下肝 细胞的活力和电解质生理浓度，其所含的组分主要是能够减轻细胞内酸化，减轻氧自由基 损伤、稳定细胞膜结构、补充细胞能量丢失、减少低温导致的细胞水肿。在配方设计上，吸收 了 UW液、HTK液的优点同时具备了自己明显的特点1.具有强大的缓冲能力。选取两种缓冲对，ΗΡ04/Η2Ρ04及柠檬酸盐(枸橼酸盐) 两种缓冲对，防止细胞在低温状态的酸化作用。2.选用非渗透性保护剂海藻糖(trehalose)，起到稳定细胞膜和蛋白质结构的作 用，减轻低温状态下细胞水肿。3.添加了外源性三磷酸腺苷、氯化镁作为再生高能磷酸化合物的底物，通过 ATP-Mg2+为细胞提供能量。4.采用还原型谷胱甘肽及有万能抗氧化剂之称的α-硫辛酸作为抗氧化系统及 抗凋亡系统，防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤。5.引入中药的活性成分苦参碱，利用其抗氧化性，增强保护作用。6.用羟乙基淀粉，提高胶体渗透压的方法，减轻细胞水肿。附图说明图1为本专利技术的保存液、UW液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞后细胞存活率比 较示意图；图2a、2b、2c为本专利技术的保存液、Uff液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞24h后 细胞Α0/ΡΙ双染X400显微观察图；图3a、3b、3c为本专利技术的保存液、Uff液、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物人工肝用肝细胞的保存液，为超纯水配制的溶液，其特征在于，该溶液中包含如下浓度范围的组分：十二水磷酸氢二钠１５－２５ｍｍｏｌ／Ｌ二水磷酸二氢钠１－１０ｍｍｏｌ／Ｌ一水枸橼酸钾４－６ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠１０－３０ｍｍｏｌ／Ｌ六水氯化镁５－１０ｍｍｏｌ／Ｌ三磷酸腺苷二钠３－１０ｍｍｏｌ／Ｌ还原性谷胱甘肽１－５ｍｍｏｌ／Ｌα－硫辛酸０．１－０．５ｍｍｏｌ／Ｌ海藻糖１００－１５０ｍｍｏｌ／Ｌ羟乙基淀粉２００／０．５１０－５０ｇ／Ｌ苦参碱２－１０ｍｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
一种生物人工肝用肝细胞的保存液，为超纯水配制的溶液，其特征在于，该溶液中包含如下浓度范围的组分十二水磷酸氢二钠15 25mmol/L二水磷酸二氢钠 1 10mmol/L一水枸橼酸钾4 6mmol/L氯化钠 10 30mmol/L六水氯化镁 5 10mmol/L三磷酸腺苷二钠 3 10mmol/L还原性谷胱甘肽 1 5mmol/Lα 硫辛酸 0.1 0.5mmol/L海藻糖 100 150mmol/L羟乙基淀粉200/0.5 10 50g/L苦参碱 2 10mg/L。2.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液的PH为 7. 2-7. 4。3.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液的渗透 压为 305士 10mmol/L。4.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液中包含 如下浓度的组分十二水磷酸氢二钠7163mg/L二水磷酸二氢钠780mg/L一水枸橼酸钾1622mg/L氯化钠1168mg/L六水氯化镁1827mg/L三磷酸腺苷二钠2755mg/L还原性谷胱甘肽922mg/Lα-硫辛酸41mg/L海藻糖47287....
【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，秦佳升，潘明新，徐小平，蒋泽生，张志，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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