多孔网架机构基质的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种多孔网架机构基质的制备方法，依次包括以下步骤：１）将壳多糖溶于质量浓度为１．４～１．６％的乙酸溶液中，得壳多糖的乙酸溶液；２）将壳多糖的乙酸溶液均匀搅拌至泡沫状，然后液氮速冻；再真空冷冻干燥；３）将所得的海绵状多孔网架置于质量浓度为８～１２％的ＮａＯＨ溶液中浸泡，取出后以双蒸水洗至所得洗涤液为中性；３６．５～３７．５℃烘干，得多孔网架机构基质。该多孔网架机构基质用于细胞的三维培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物实验用基质材料的制备
，特别是涉及一种用于细胞三维 培养的多孔网架结构基质的制备方法及其用途。
技术介绍
常规的体外单层细胞培养，具有培养简单、易操作、费用低等优点；但是细胞附在 底物平面上生长，缺少立体支架，只能向二维发展，不能生成细胞外基质，由于缺乏体内特 异性生长因子及分化因子，细胞不能分化而失去原体内时的立体形态。目前用于细胞三维培养的基质是胶原蛋白水凝胶，存在易降解、制备工艺复杂、保 存运输困难等问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种无毒、无刺激、生物相容性良好、可生物降解 的多孔网架机构基质的制备方法及其在三维细胞培养中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种多孔网架机构基质的制备方法，包括以 下步骤1)、将壳多糖溶于质量浓度为1. 4 1. 6%的乙酸溶液中，得壳多糖的乙酸溶液； 所述壳多糖占壳多糖的乙酸溶液总重的1. 8 2. 2% ；2)、将壳多糖的乙酸溶液以1000 5000r/min的搅拌速度均勻搅拌至泡沫状，然 后液氮速冻4 6分钟(液氮速冻的目的是为了铸型)；再真空冷冻干燥，得海绵状多孔网 架；3)、将海绵状多孔网架置于质量浓度为8 12%的NaOH溶液中浸泡2. 5 3. 5h， 取出后以双蒸水洗至所得洗涤液为中性；36. 5 37. 5°C烘干，得多孔网架机构基质。作为本专利技术的多孔网架机构基质的制备方法的改进步骤2)的搅拌时间为15 30mino本专利技术还同时提供了上述多孔网架机构基质的用途用于细胞的三维培养。本专利技术的多孔网架机构基质是利用冷冻干燥技术将作为高分子聚合物的壳多糖 铸形制成的，具有无毒、无刺激、生物相容性良好、可生物降解等特性。实际使用时，本专利技术的多孔网架机构基质需先进行如下使用前预处理1)、将多孔网架机构基质先于D-Hanks中浸泡24h，然后于质量浓度75%乙醇溶液 中浸泡30min，接着在紫外灯(波长为200-275nm，功率为10-30W)下照射60min，最后在常 规培养基中浸泡至少24h ；得浸泡后基质；常规培养基DMEM培养基加15%胎牛血清，即DMEM培养基胎牛血清= 85 15(体积比)；该DMEM培养基例如可选用上海肯强仪器有限公司提供的代号为D5921D 的DMEM培养基低糖(液体)。2)、将上述浸泡后基质放入细胞培养液中浸泡4-8小时；3该细胞培养液为与所需培养的细胞所对应的常规细胞培养液。综上所述，本专利技术开发了一种模拟体内支架系统的多孔网架机构基质，创建了类 似体内的生长环境，使细胞通过紧密连接和缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外 基质间的联系，形成一定的三维结构，从而促进细胞增殖、分化及呈现出类似体内组织结构 和功能性状。具体实施例方式实施例1、一种多孔网架机构基质的制备方法，依次进行以下步骤1)、将作为高分子聚合物的壳多糖(吉林德众生物技术开发有限公司，分析纯，脱 乙酰度95 % )溶于质量浓度为1. 5 %的乙酸水溶液中，配成浓度为2 %的壳多糖的乙酸溶液 (即壳多糖在壳多糖的乙酸溶液中的质量浓度为2% )。2)、将壳多糖的乙酸溶液以3000r/min的速度搅拌30分钟至均勻泡沫状，迅速移 至器皿中，液氮速冻5分钟，铸型后，真空冷冻干燥(于_40°C干燥30分钟)，形成海绵状多 孔网架。3)、将上述海绵状多孔网架在10% (质量浓度)的NaOH溶液中浸泡3h，取出后以 双蒸水洗至所得洗涤液为中性；然后37°C烘干6-12小时，得多孔网架机构基质，备用。所得多孔网架机构基质的孔径在80-165微米之间，平均三维孔隙率为79%。将上述多孔网架机构基质进行如下预处理后，用于传代软骨细胞(2. OX IO6Cell/ ml)的培养1)、将多孔网架机构基质先于D-Hanks中浸泡24h，然后于质量浓度75%乙醇溶液 中浸泡30min，接着在紫外灯(波长为250nm，功率为20W)下照射60min，最后在常规培养基 中浸泡24h ；得浸泡后基质；常规培养基DMEM培养基加15%胎牛血清，即DMEM培养基胎牛血清= 85 15(体积比)；该DMEM培养基例如可选用上海肯强仪器有限公司提供的代号为D5921D 的DMEM培养基低糖(液体)。2)、将上述浸泡后基质放入细胞培养液中浸泡4-8小时；细胞培养液=DMEM F12 = 3 1 (体积比)，含15%胎牛血清，胰岛素6mg/L,青霉 素1. 0*105U/L，链霉素100mg/L，转铁蛋白5mg/L，两性霉素B 250微克/L。3)、将细胞植入步骤2)所得的含细胞培养液的基质中，于37°C的条件下进行培养。培养2-3天后，观察表明软骨细胞在网架上粘附、增殖良好，对细胞液进行检测 发现有细胞分泌细胞外基质，组织学观察显示有新生软骨组织形成。上述结果等同于将传代软骨细胞(2. OX 106cell/ml)放入传统的胶原蛋白水凝胶 中进行培养所得的结果。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本专利技术的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本专利技术公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多孔网架机构基质的制备方法，其特征是依次包括以下步骤：　　１）、将壳多糖溶于质量浓度为１．４～１．６％的乙酸溶液中，得壳多糖的乙酸溶液；所述壳多糖占壳多糖的乙酸溶液总重的１．８～２．２％；　　２）、将壳多糖的乙酸溶液以１０００～５０００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度均匀搅拌至泡沫状，然后液氮速冻４～６分钟；再真空冷冻干燥，得海绵状多孔网架；　　３）、将海绵状多孔网架置于质量浓度为８～１２％的ＮａＯＨ溶液中浸泡２．５～３．５ｈ，取出后以双蒸水洗至所得洗涤液为中性；３６．５～３７．５℃烘干，得多孔网架机构基质。

【技术特征摘要】
一种多孔网架机构基质的制备方法，其特征是依次包括以下步骤1)、将壳多糖溶于质量浓度为1.4～1.6％的乙酸溶液中，得壳多糖的乙酸溶液；所述壳多糖占壳多糖的乙酸溶液总重的1.8～2.2％；2)、将壳多糖的乙酸溶液以1000～5000r/min的搅拌速度均匀搅拌至泡沫状，然后液氮速冻4～6分钟；再真空冷冻干燥，得海绵状多孔网架；3)、将海绵状多孔网...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁秋萍，余志扬，杨军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]