本发明专利技术涉及一种吸水链霉菌抗真菌活性物质的提取方法，其包括步骤１．吸水链霉菌ＢＳ－１１２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ?ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ?ＢＳ－１１２）（ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３５０４）通过发酵得到发酵液；２．发酵液离心后的上清液经Ｘ－５树脂吸附；３．用７０％～８０％乙醇对抗真菌活性物质进行解吸；４．收集解吸液，减压蒸发浓缩，冷冻干燥得到抗真菌活性物质的提取物。本发明专利技术提供的吸水链霉菌ＢＳ－１１２抗真菌活性物质的提取方法简便、生产周期短、成本低，适于大规模生产。本发明专利技术得到的抗真菌活性物质对粮食和饲料中的主要霉变真菌以及多种家蚕和植物病原真菌具有广谱的抗菌活性且毒性低，在食品和饲料防腐剂、家蚕真菌病害和植物真菌病害的生物防治上均具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。属于生物制药技术领 域。
技术介绍
本专利技术的目的在于提取吸水链霉菌BS-112发酵产生的抗真菌活性物质用于防治 粮食及饲料中的黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等主要霉变真菌。霉菌毒素是真菌所产生的次级有毒代谢物，它们存在于丝状真菌的菌丝体和孢子 内，广泛污染粮食、食品及饲料等。据联合国粮农组织估算，目前世界上至少有25%的谷物 被霉菌毒素污染，每年所造成的经济损失高达数千亿美元。我国是霉菌毒素的重灾区，一些 地区尤其是南方地区饲料霉变问题相当严重。由于霉菌的生长消耗了饲料中的营养物质， 饲料受霉菌污染后，营养价值严重降低。动物采食了霉菌毒素污染的饲料后，可引起霉菌毒 素中毒，生长受到抑制，饲料利用率降低，产仔数降低，禽类的产蛋率和孵化率下降等。而 且摄入动物体内的霉菌毒素能够破坏畜禽的代谢解毒器官，降低其免疫力和对疾病的抵抗 力。更为严重的是，霉菌毒素可沉积在动物的肝、肾、肌肉、乳汁及禽蛋等动物产品中，通过 食物链对人类健康产生极大的潜在危害。因此如何预防和控制饲料中的霉菌毒素，降低其 危害，已成为国内外研究的热点。目前人们主要通过控制水分和低温等技术处理粮食及其制品来防止霉菌生长，并 通过物理、化学的方法消减霉菌毒素含量。但是这些方法具有破坏营养、去毒不彻底和成本 高等缺陷，从而造成实际防控、脱毒效果不理想。利用生物技术防控、消减霉菌毒素不仅不 破坏食物的营养成分，而且无残留毒性、不污染环境和对人畜安全。目前相关的研究主要集 中在筛选、利用拮抗微生物及植物产生的抗菌物质来防控粮食及其制品的霉变，如变色栓 菌(Trametes versicolor)产生一类抑制寄生曲霉产毒的物质可有效地防治玉米、小麦的 霉变；Ono等从链霉菌中提取了一种能抑制黄曲霉毒素产生的物质，该物质与杀稻瘟素结 构类似。吸水链霉菌Str印tomyces hygroscopicus BS-112由本实验室从泰山林地土壤 中分离获得，该菌株对黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等粮食和饲料中常见的霉菌具有较强拮抗作 用，发酵性状优异，产生的抗真菌活性物质性质稳定，具有作为饲料和粮食防腐剂的潜力。 另外，该菌株产生的抗真菌活性物质还对白僵菌、绿僵菌、黄曲霉等家蚕病原真菌及立枯丝 核菌等植物病原真菌也具有较好的抑制作用。
技术实现思路
本专利技术提供了。本专利技术采用如下技术方案实现一种吸水链霉菌，该菌株表述为吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)BS-112。已于2009年12月13日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院 微生物研究所。邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3504。3本专利技术的BS-112菌株是从泰山林地土壤中筛选得到的，该菌株对粮食及饲料中 常见霉变真菌(黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉)、家蚕病原真菌(白僵菌、绿僵菌、 黄曲霉)及植物病真菌(番茄灰霉病菌、烟草炭疽病菌、立枯丝核菌、苹果轮纹病菌、杨树腐 烂病菌)等均有较好的抑制效果，且该菌株具有良好的传代抑菌稳定性。BS-112菌株具有 以下特征①高氏一号培养基上气生菌丝白色，日久成灰色，并有明显的吸水斑，基内菌丝 淡黄色，可溶性色素黑色；②孢子丝呈紧密螺旋形，孢子为卵圆形，孢子表面有疣。③生理 生化特征为能使牛奶凝固，淀粉水解，产生硫化氢；可以在15 40°C环境下生长，最适生 长温度为28°C，存活pH值为4 10，耐盐性较好；可以利用葡萄糖、麦芽糖、甘油、木糖、果 糖、蔗糖、肌醇、甘露醇、醋酸钠和棉子糖；④16S rDNA序列分析结果在GenBank数据库中进 行序列最大同源性比对，发现BS-112菌株与链霉菌属的遗传距离最近，与已知菌株链霉菌 32(2) (EF063464)的 16S rDNA 序列同源性达到 99. 87%。通过对BS-112菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分及16S rDNA序列分析，确定其为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。本专利技术的目的是给出吸水链霉菌BS-112抗真菌活性物质的提取方法，本专利技术利 用大孔吸附树脂法提取BS-112菌株产生的抗真菌活性物质，具有设备简单、操作方便、生 产周期短、成本低等优点，利于工业化生产。该抗真菌活性物质对粮食及饲料中的主要霉变 真菌具有高效广谱抗性，具有作为食品和饲料防腐剂的潜力。此外，该抗真菌活性物质还对 多种家蚕及农作物的病原真菌具有较好的抑制作用，在养蚕业及农业上也具有潜在应用价 值。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案(1)菌种活化及种子液制备将斜面保存的吸水链霉菌BS-112转接至PDA培养基 平板上，于28 30°C培养72 96小时；在种子液培养基(PDA培养基中不加琼脂的液体 培养基)中接入活化的BS-112菌种，摇床培养。种子液培养条件温度28 30°C，摇床转 速180 200转/分，培养时间36 48小时；(2)菌株发酵将种子液接种于发酵培养基中，摇瓶发酵，发酵完成后离心收集发 酵上清液。发酵培养基为复合培养基，各组分及其质量浓度为玉米粉1.0% 2.0%，葡萄 糖 1. 5% 2. 5%，蛋白胨 1. 5% 2. 5%, MgSO4O. 5% 1. 0%, KH2PO4O. 5% 1. 0%，其余 为水。发酵条件温度28 30°C，摇床转速180 200转/分，接种量(种子液体积与发 酵液体积的百分比) 3%，发酵时间84 96小时；(3)大孔吸附树脂吸附将X-5树脂与发酵液离心后的上清液按质量体积比 1 25 1 30混合，在20 30°C下，转速为100 120转/分，振荡吸附2 3小时；(4)解吸剂解吸将吸附后的X-5树脂收集装入层析柱中，先用2 3倍(树脂)柱 体积的去离子水冲洗树脂，再用浓度为70% 80%的乙醇进行解吸，流速为0. 8 1. 2mL/ min，从色素带流出开始收集解吸液，约为2. 5 3. 5倍柱体积后停止收集；(5)抗真菌活性物质获得将收集到的解吸液减压蒸发浓缩、冷冻干燥后即为本 专利技术的最终产品——吸水链霉菌BS-112抗真菌活性物质。吸水链霉菌BS-112产生的抗真菌活性物质回收率计算生测平板的制备PDA培养基熔化后，温度降至50 55°C，加入黄曲霉孢子悬液， 使孢子的浓度为2 4X 104CFU/mL，将培养基孢子悬液倒入培养皿，20mL/培养皿，制备混4菌平板；效价的测定采用牛津杯法，将抗真菌活性物质溶液加入牛津杯中(200 μ L/孔)， 28 30°C培养18 24小时，十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈的直径大小计算其 效价，抗真菌活性物质效价计算公式Y = 10(X+2L153)/15·577 Xniy 抗真菌活性物质效价(μ g/ mL) ；χ 抑菌圈直径(9. 3mm<x< 19. 2mm) ；η 稀释倍数〕；回收率计算方程抗真菌活性物 质回收率=Y1V1AVa1 解吸液的效价乂 解吸液的体积；Y 发酵液离心后的上清液的效 价；V 发酵液离心后的上清液的体积)。根据本专利技术提取的吸水链霉菌BS-112抗真菌活性物质具有以下优点(1)抗菌广谱性好，对引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种吸水链霉菌抗真菌活性物质的提取方法，其特征在于包括以下步骤： ａ、将斜面保存的吸水链霉菌ＢＳ－１１２转接至ＰＤＡ培养基平板上，于２８～３０℃培养７２～９６小时；将活化的菌种接入种子液培养基中，摇床培养；种子液培养条件为：温度２８～３０℃，摇床转速１８０～２００转／分，培养时间３６～４８小时； ｂ、将种子液接种至发酵培养基中，摇瓶发酵，发酵完成后将发酵液离心，收集上清液；发酵培养基为复合培养基，各组分及其质量浓度为：玉米粉１．０％～２．０％，葡萄糖１．５％～２．５％，蛋白胨１．５％～２．５％，ＭｇＳＯ↓［４］０．５％～１．０％，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．５％～１．０％，其余为水；发酵条件为：温度２８～３０℃，摇床转速１８０～２００转／分，接种量（种子液体积与发酵液体积的百分比）为１％～３％，发酵时间８４～９６小时； ｃ、将大孔吸附树脂与发酵液离心后的上清液按一定比例混合，在２０～３０℃下，转速为１００～１２０转／分，振荡吸附２～３小时； ｄ、将吸附后的树脂收集装入层析柱中，先用２～３倍树脂柱体积的去离子水冲洗树脂，再用解吸剂以流速０．８～１．２ｍＬ／ｍｉｎ进行解吸，从色素带流出开始收集解吸液，收集２．５～３．５倍树脂柱体积后停止收集； ｅ、将收集的解吸液蒸发浓缩，冷冻干燥后所得到的干物即为抗真菌活性物质。...
【技术特征摘要】
一种吸水链霉菌抗真菌活性物质的提取方法，其特征在于包括以下步骤a、将斜面保存的吸水链霉菌BS 112转接至PDA培养基平板上，于28～30℃培养72～96小时；将活化的菌种接入种子液培养基中，摇床培养；种子液培养条件为温度28～30℃，摇床转速180～200转/分，培养时间36～48小时；b、将种子液接种至发酵培养基中，摇瓶发酵，发酵完成后将发酵液离心，收集上清液；发酵培养基为复合培养基，各组分及其质量浓度为玉米粉1.0％～2.0％，葡萄糖1.5％～2.5％，蛋白胨1.5％～2.5％，MgSO40.5％～1.0％，KH2PO40.5％～1.0％，其余为水；发酵条件为温度28～30℃，摇床转速180～200转/分，接种量(种子液体积与发酵液体积的百分比)为1％～3％，发酵时间84～96小时；c、将大孔吸附树脂与发酵液离心后的上清液按一定比例混合，在...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘训理，张楠，毛志泉，宋振，张本峰，于建，国辉，仇念全，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[]
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